应力微环境下MSCs成软骨分化过程中凋亡机制的研究

软骨一旦缺损自身很难修复，组织工程是修复软骨缺损最有前景的治疗模式之一。间充质干细胞(MSCs)作为软骨组织工程种子细胞，在构建工程化软骨时遇到的最大瓶颈是细胞扩增效率不高；而细胞扩增受增殖和凋亡共同调控。申请人前期发现应力能促进MSCs保持增殖并分化为软骨细胞，且Notch信号参与了此过程中的力学-生物学响应。在此基础上研究力学调控下的细胞凋亡，有助于深入理解应力对MSCs成软骨分化的调控机制、进而提高软骨创伤疾病的防治水平。.本项目拟在前期建立的应力微环境下大鼠MSCs成软骨分化细胞学模型的基础上，研究应力刺激对凋亡早、中、晚各期的调控规律；采用RT-PCR和激光共聚焦显微镜技术，检测Notch受/配体信号各通路的表达情况；并采用基因转染和RNA干扰技术分别对表达最弱和最强的Notch信号进行反向调控，研究Notch信号对细胞凋亡的调控机制，为促进MSCs向软骨细胞定向扩增提供新途径。

软骨组织的再生能力有限,一旦缺损自身很难修复。间充质干细胞(MSCs)作为软骨组织工程种子细胞，在构建工程化软骨时遇到的最大瓶颈之一是细胞扩增效率不高。包括课题组在内的大量研究已广泛证实了应力刺激对MSCs成软骨分化过程的调节效应。本项目通过对成软骨相关表型表达规律进行研究，发现适当延迟应力加载介的入时机能更有效促进BMSCs成软骨分化。进一步研究发现，延迟应力加载是通过促进内源性TGF-β的表达和活化来调控细胞的成软骨分化的，其机制可能通过促进Smad2/3的磷酸化和核转移，也通过非Smad途径，比如p38、 ERK1/2、RhoB和Wnt7a。在BMSCs在成软骨分化过程中增殖活性下降且峰值提前，而适当的应力刺激可通过调控细胞周期素Cyclin D1以及其依赖性激酶CDK4，调节大鼠BMSCs成软骨分化过程中细胞增殖。在上述延迟应力加载模型的基础上，本项目采用透射电镜、PI/Annexin V双标染色、线粒体膜电位检测（JC-1）、原位末端标记（TUNEL）、流式细胞术（FCM）等检测细胞凋亡，结果提示：在大鼠BMSCs成软骨分化过程中凋亡细胞较非诱导细胞有明显增加，且与压力加载有明显相关性: 静压加载下BMSCs成软骨分化过程中凋亡增加、时象提前，而动态压应力加载早期凋亡细胞和坏死较对照组减少，而后期凋亡略有增加。适当力值、周期性加载和间断应力刺激能通过调节细胞凋亡的时象和数量，利于成软骨分化过程的进展。Notch-1参与了BMSCs成软骨分化过程中的力学-生物学响应，但对动/静态压应力刺激应答不同。在动态应力刺激对BMSCs成软骨分化的调控过程中抑制Notch信号的表达后，细胞凋亡现象明显下降。说明Notch信号不仅参与了大鼠BMSCs成软骨分化过程中的凋亡调控，而且还参与了应力刺激对此过程中的凋亡调控。进一步研究发现，Notch信号是通过NO途径和Caspase-3、Caspase-8等调控压应力诱导的BMSCs成软骨分化过程中的细胞凋亡，从而调节应力刺激对干细胞的成软骨分化的。这说明Notch 信号通路作为力学信号转导过程中的一环，通过调控细胞的凋亡对细胞的分化过程进行了干预和调节。