安吉白茶阶段性返白时期RING型E3泛素连接酶基因SP1的功能研究

SUPPRESSOR OF PPI1 LOCUS1 (SP1), a RING-type ubiquitin ligase (E3) protein, regulates chloroplast biogenesis by the ubiquitin-proteasome system. In our previous studies, the expression levels of ubiquitylation-related genes were higher in the albino phase than in the re-greening phase in Anjibaicha. AnjiBaicha is a kind of specific variety with reversible albinism in spring shoots. During the albescent stage, the content of chlorophyll sharply decreased and the amount of amino acids significantly increased in albino leaves. In the present study, we will use SMART RACE to clone CsSP1 genes of a RING-type E3 protein. the promoter of CsSP1 would be cloned by TAIL-PCR and the subcellular location of CsSP1 could be performed by observation of gene expression level of GFP driven by promotor of CsSP1 under fluorescence microscope. Furthermore, we will construct overexpression and RNAi vectors, which are identified in tobacco and tea plant genetic transformation system, to uncover verify function of CsSP1 in the albescent stage of Anjibaicha, combining with Northern blotting, RT-qPCR, HPLC and transmission electron microscope(TEM). The proposed work is very significant for the specific phenotype in Anjibaicha and will lay the foundation of the molecular breeding and germplasm innovation by understanding the growth and regulation mechanism in tea plant.

SP1基因编码E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）蛋白，能够通过泛素-26S蛋白酶体途径（UPS）来调控叶绿体的发育。申请人前期研究发现，茶树泛素化酶基因在安吉白茶阶段性返白期间相对表达量较高。为此，本研究以安吉白茶为试验材料，采用SMART RACE技术，克隆茶树RING型E3泛素连接酶SP1基因全长cDNA，采用Tail-PCR技术克隆其启动子，以β-葡萄糖苷酸酶（GUS）作为报告基因，构建表达载体，以确定启动子的活性和功能。通过构建过表达和RNA干扰表达载体，分别转化烟草和茶树，结合透射电镜、HPLC技术、Northern杂交和RT-qPCR技术进行验证，将揭示SP1基因在安吉白茶阶段性返白时期的功能。本研究对于阐明安吉白茶特异性状形成的机理具有重要的意义。茶树中该基因的发掘与利用将有助于揭示茶树生长发育的精确调控过程，为茶树分子育种和种质创新奠定良好的基础。

三年来，我们按照计划对本项目开展研究，主要取得了以下研究结果：. 克隆了茶树E3泛素连接酶SP1基因，并进行了相关生物信息学分析；分析了安吉白茶阶段性返白期间（返白初期、返白中期、最白期、复绿初期、复绿中期、完全复绿期整个过程）SP1基因及部分泛素活化酶E1和泛素结合酶E2基因相对表达水平。. 建立了一种快速测定茶鲜叶中β-胡萝卜素的高效液相色谱方法。色谱条件为：SunFireTM C18 (150 mm×4.6 mm， 5 µm )色谱柱；三氯甲烷-乙腈溶液为流动相；波长450 nm；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃。茶鲜叶中β-胡萝卜素能达到基线分离的效果，线性关系良好，该方法具有良好的稳定性和准确度。. 以茶树叶片为外植体材料，通过筛选外植体类型、培养基种类和茶树品种，利用液固共培养和暗培养相结合的办法，可明显降低茶树组织培养过程中外植体褐化率，显著提高茶树叶片愈伤组织的增殖率。. 以茶树七成熟种子为外植体材料，采用MS+6-BA 3.5~4 mg/L+IBA 1.5 mg~2 mg/L培养基，可诱导出体细胞胚并获得良好的增殖，将体细胞胚转入MS+6-BA 2.0~2.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+1 mg/L L-谷氨酰胺培养基中，能诱导出不定芽，在MS+1.0 mg/L IBA或MS+红壤生土+0.3 mg/L NAA配方培养基中能诱导不定芽生根。. 研究了云芝多糖能较好的抑制茶树组织培养内生菌污染，同时在培养基中添加不同浓度的云芝多糖（CVP）后，茶树体细胞胚和愈伤组织的外观、组织形态和抗氧化酶活性都发生了显著的变化。 当CVP添加浓度为6 g/L时，茶树愈伤组织和培养基表面均无内生菌出现，外观淡黄有光泽，活力强，茶树愈伤组织的细胞变大，壁边界明显，生命力旺盛，抗氧化酶活性除了 CAT和APX外，SOD、POD、MDA和GSH-PX的酶活性都显著升高。. 以茶树愈伤组织和体细胞胚为外植体，对农杆菌介导的茶树遗传转化体系的预培养时间、共培养的方式、抗生素种类、抗生素浓度及培养的条件进行优化，初步建立茶树遗传转化体系。