Cu2+/Aβ共聚集诱导小胶质细胞激活的K+通道相关分子机制研究

Abnormally aggregated forms of Aβ, which accumulate extracellularly, is the most important pathogenic factor for excessive activation of microglia in Alzheimer's disease (AD). Redox-active Cu2+ can act as a cofactor to induce the changes of Aβ conformation and the subsequent co-aggregation, leading to formation of Cu2+-Aβ complex. However, whether this complex activates microglia is still unknown. The results of our preliminary experiments demonstrate that Cu2+-Aβ complex (with a molar ratio of 1:1) elicits microglial activation at a sub-neurotoxic dose, in which K+ channels and mitochondrial H2O2 might be involved. Therefore, the present study is aimed to: 1) clarify the type of K+ channel mediating Cu2+-Aβ complex-induced microglial activation; 2) determine the key signaling pathway through which activation of this K+ channel causes production of mitochondrial reactive oxygen species, which leads to NF-kB-dependent inflammatory responses. The results will shed new light on the understanding of mechanisms for the early stage of neuron degeneration in AD, and may be helpful in search of molecular targets for prevention and early intervention.

细胞外异常聚集态Aβ为AD脑内小胶质细胞（MG）过度激活最重要诱因，氧还活性Cu2+可作为重要辅因子诱导Aβ变构而形成共聚集复合物，但该复合物对MG的激活作用及其分子机制未见报道。申请者的预实验结果提示，等摩尔比Cu2+-Aβ配位结合及共聚集诱发亚神经毒性剂量下的MG激活效应，该效应与K+通道及线粒体释放H2O2相关。本研究拟采用计算机分子动力学模拟、细胞和分子生物学、电生理学等手段，在细胞、组织和整体水平，试图阐明介导Cu2+-Aβ复合物MG激活作用的细胞膜K+通道类型，及其诱发线粒体活性氧释放而导致NF-kB依赖性炎症反应的关键信号通路，并确定可干预的分子靶标。研究结果对于解析AD神经元退变的早期机制，探寻有预防和早期干预价值的分子靶标，具有较重要理论和临床价值。

小胶质细胞（MG）介导的中枢炎症反应是（AD）神经元损伤关键机制。胞外聚集态Aβ为AD脑内MG过度激活最重要诱因，氧还活性Cu(II)可作为重要辅因子诱导Aβ变构而形成共聚集复合物，但其对MG的激活作用及分子机制未明。本课题组预实验结果提示，等摩尔比Cu(II)-Aβ共聚集可诱发亚神经毒性剂量下MG激活效应，该效应与K+通道及线粒体释放活性氧（mtROS）相关。本项目采用计算机分子动力学模拟、生物化学、细胞和分子生物学、组织学和电生理学等手段，对介导Cu(II)-Aβ复合物（Cu-Aβ）MG激活作用的细胞膜K+通道类型，及其诱发mtROS释放而导致NF-kB依赖性炎症反应的关键信号通路进行了较详细研究。取得了如下原创性研究成果：1）Cu-Aβ互作可改变Aβ结构和性质；2）亚神经毒性剂量Cu-Aβ可诱导MG激活态，并促进TNF-α和NO释放及NF-κB激活；3）Cu-Aβ可诱导MG ROS释放；NADPH氧化酶（NOX）抑制剂未能抑制该ROS释放；Cu-Aβ刺激后MG线粒体内超氧化物迅速累积，提示线粒体可能是Cu-Aβ诱发ROS的主要来源；4）Cu-Aβ处理MG后的条件培养液可致海马神经元树突损伤；TNF-α抑制剂PTX联合NOS抑制剂氨基胍（AG），以及ROS抑制剂乙酰半胱氨酸（NAC）预处理，均能抑制MG介导的神经毒性；5）Cu-Aβ通过激活PI3K/Akt-ERK1/2信号通路调控MG激活；6）应用apamin和tamapin等小电导Ca2+激活K+通道（SK）阻断剂预处理MG，或应用siRNA下调MG内SK3表达后，Cu-Aβ激活MG作用明显减弱，提示Cu-Aβ通过SK3激活MG；7）apamin预处理后，Cu-Aβ刺激MG后不再引起Akt和ERK1/2磷酸化以及NF-κB 激活，提示细胞膜SK3 K+通道可能是Cu-Aβ的初始靶点；8）NAC和apamin可抑制Cu-Aβ海马内注射后所致MG激活、神经元树突损伤以及学习记忆功能障碍。综上，本课题组首次证实Cu-Aβ具有早于其直接神经元损伤作用的MG激活效应，该效应由SK3-PI3K/Akt-ERK1/2-NF-κB信号通路介导，通过诱发mtROS释放导致NF-kB依赖性炎症反应及其介导的神经元毒性。项目研究结果对于解析AD神经元退变的早期机制，探寻有预防和早期干预价值的分子靶标，具有较重要理论价值。