三种人畜共患传染性病原菌同步快速富集与检测技术研究

In recent years,zoonosis has become a main emerging public infectious disease .It is necessary to study on the synchronous,rapid and accurate detection technologies of its ralated pathogens. This topic is to design a specific fusion protein antigen of three kinds of zoonotic infectious pathogens with higher prevalence including Brucella, escherichia coli O157: H7 and L.monocytogenes by using of fusion protein technology,and to obtain a method aiming at the synchronization enrichment and rapid-accurate detection of these three pathogens in samples by using magnetic nanotechnology and quantum dot labeling technique and the principles of immunology. This topic research contents include:① preparation and characterization of surface-functionaled magnetic nanoparticles;② preparation and characterization of three kinds of pathogenic bacteria specific antigen fusion protein and their yolk antibody（IgY）; ③ the preparation of magnetic nano-biological probe; ④ preparation of rabbit polyclonal antibodies of three kinds of pathogenic bacterias and their immunization fluorescence quantum dots; ⑤ Synchronous,rapid,qualitative and quantitative analysis of the three kinds of antigens in samples by means of fluorescence microscopic imaging technology and fluorescence spectrometer.The purpose of this research is to design and prepare magnetic nano-biological probe and fluorescent quantum dot bio-probes with our own intellectual property and broad prospect ,which can be used to enrich these three common zoonotic infectious pathogens synchronously and detect them rapidly and accurately.

近年来，人畜共患传染病已成为新发公共卫生传染病的主要疾病，加强对其同步、快速、准确的检测技术研究十分必要。本课题是利用融合蛋白技术设计合成布鲁氏菌、大肠杆菌O157:H7以及单增李斯特菌三种发病率较高的人畜共患病传染性病原菌的特异融合蛋白抗原，联合磁纳米技术和量子点标记技术，利用免疫学的原理实现对待检样品中三种病原菌同步富集与快速准确检测。课题的主要研究内容包括：①表面功能化磁性纳米粒子的制备及表征；②三种病原菌特异融合蛋白抗原及其鸡卵黄抗体IgY的制备及鉴定；③磁性纳米生物探针的制备；④三种病原菌兔多克隆抗体及免疫化荧光量子点的制备；⑤借助荧光显微成像技术和荧光光谱仪对待检样品进行同步、快速定性及定量检测。课题研究的目的是设计制备具有我国自主知识产权和广泛应用前景的能同步富集三种病原菌的磁性纳米生物探针和荧光量子点生物探针，实现对三种常见人畜共患传染性病原菌同步快速、准确检测。

大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌及布鲁氏菌是我国及国际法定的人畜共患传染病病原菌，加强对其同步、快速、准确的检测技术研究十分必要。本课题利用卵黄抗体技术制备能够同时识别这三种病原菌的卵黄抗体，并将其与羧基磁珠偶联制备免疫磁探针，利用免疫磁分离技术实现对待测样品中三种病原菌的同步快速富集与分离，联合量子点标记技术，实现对三种病原菌同步富集与快速准确检测。.经过四年的研究，课题研究工作已完成，并取得预期的研究成果。课题总体研究工作简介如下：(1) 完成了表面功能化磁性纳米粒子的制备及表征工作，获得了磁性优良、形状规则、粒径均一，且表面含有羧基的磁性纳米粒子。(2) 利用融合蛋白技术设计合成了三种病原菌特异抗原融合蛋白，同时利用卵黄抗体制备技术完成了三种病原菌特异性鸡卵黄抗体IgY 的制备及鉴定。结果表明制备的IgY抗体效价为1:32000，蛋白含量达到21.031 mg·mL-1，特异性和纯度较好。(3)将羧基磁珠与所制备的卵黄抗体进行偶联制备可同时识别三种病原菌的免疫磁珠，经鉴定卵黄抗体被成功偶联于羧基磁珠表面。（4）采用有机相合成法完成了三种具有不同荧光发射波长的CdSe/ZnS量子点的合成，结果表明所合成的绿光、黄光和红光三种CdSe/ZnS量子点的荧光发射波长分别为539、583和618 nm，形状近似球形，粒径均一，分散性好，且表面含有羧基功能基团。(5)完成了O157:H7、单增李斯特菌及布鲁氏菌三种病原菌兔多克隆抗体IgG 的制备纯化及鉴定，纯化后的多抗效价分别达到1:128000、1:512000和1:128000，蛋白含量分别为29.06、38.27和16.78 mg·mL-1，纯度和特异性均较高。(6)将三种不同发射波长的荧光量子点分别与三种病原菌的兔多克隆抗体进行偶联，制备了三种量子点荧光生物探针。(7)通过优化检测条件，成功的建立了三种人兽共患病病原菌的同步、快速检测方法，并通过模拟样品进行实际检测效果评价，结果表明该检测方法可同步、快速、准确的检测三种病原菌，且特异性较好，灵敏度较高，可用于实际样品的检测中。该检测方法的探针制备和检测仪器相对价格较低，且具有我国自主知识产权，有望应用于疾控中心和检验检疫部门，产生较大经济效益和社会效益。 (8) 研究成果已发表论文12篇；申请发明专利5项；培养5名博士和2名硕士研究生。超额完成预定目标任。