猪场废水农田利用过程中抗生素耐药基因在蔬菜中的分布特征及转移机制研究

Livestock industry constitutes an important position in domestic development. A large amount of wastewater discharged from livestock operations, with a number of antibiotic resistant genes (ARGs) and bacterium, is applied to farmland as fertilizer posing great potential risk to environment and public health, and the study on the occurrence and transfer mechanism of ARGs in plants was deficient. The detection method of ARGs will be optimized according the different compositions in wastewater, soil and vegetable samples, and the ARGs will be investigated in typical vegetable surface and internal during farmland application of swine wastewater by field survey in the study. With modern molecular biological analysis and conventional microbial analysis methods，the dynamic changes of bacterial resistance traits, bacteria structure, ARGs and mobile genetic elements in different kinds of soil and potted vegetable surface and internal will be analyzed, in pot-test, simulating land application of swine wastewater processes, to reveal the transfer mechanism of ARGs from the environment to the vegetable surface and internal. Overall, the results of this study will provide experimental basis to assess potential risks of ARGs from swine wastewater to human health and control ARGs pollution hazards.

我国是畜禽养殖大国，排污量大。畜禽养殖废水灌溉农田广为应用，但因携带大量耐药基因和耐药菌，对环境和人类健康构成了巨大的潜在危害。然而，人们不甚清楚养殖废水农田利用中耐药基因在农田植物中的分布特征、转移机制，亟待深入研究。本研究以猪场废水中典型耐药基因为研究对象，根据废水、土壤、蔬菜样品的成分差异，优化现有的耐药基因检测方法；选择典型农田蔬菜（以根菜、叶菜、瓜果等常见蔬菜为主），通过现场调研，明确我国典型规模化猪场废水农田利用过程中耐药基因在农田蔬菜表面及内部的分布特征。模拟猪场废水农田利用过程，采用现代分子生物学和常规微生物分析方法，解析不同类型土壤、盆栽蔬菜表面及内部的细菌耐药性状、菌群结构、耐药基因和可移动遗传元件的动态变化，揭示猪场废水农田利用过程中耐药基因从环境向蔬菜表面及内部转移的微生物学机制。从而为进一步评估抗生素耐药基因对人类健康的潜在风险，控制耐药基因的污染危害提供依据。

作为畜禽养殖大国，我国畜禽养殖废水农田利用广泛，其中赋存的大量耐药基因危害环境和人类健康。针对目前ARGs在农田植物中的蓄积、转移机制的研究匮乏，本研究以典型ARGs为研究对象，建立蔬菜残留ARGs的检测方法；现场调研养猪场周边农田中生食蔬菜ARGs的赋存特性、存在丰度；通过盆栽试验，揭示养殖废水灌溉对栽培蔬菜、土壤菌群结构、ARGs和可移动遗传元件蓄积的影响，探讨猪场废水农田利用过程中，ARGs借助微生物从环境向蔬菜转移的潜在机制。调研发现，生食蔬菜的磺胺类、四环素类ARGs存在范围最广，sulⅠ和tetM的检出率最高；蔬菜表面ARGs种类及丰度均高于蔬菜内部；根菜樱桃萝卜可食部ARGs存在丰度显著高于叶菜（p<0.01）。盆栽试验发现，共检出1类整合子（Int 1）和22种ARGs，囊括五类不同的耐药机制；栽培蔬菜及土壤中ARGs绝对丰度分别介于102-105copies/g和103-107copies/g，其中磺胺类ARGs的绝对丰度最高；施加猪场废水的栽培蔬菜、土壤ARGs的多样性、丰度均高于未施加肥料的空白样品（p<0.01）；而不同类型土壤对ARGs的蓄积影响不明显；栽培蔬菜的土壤中ARGs丰度低于相同施肥处理的未栽培蔬菜的土壤（p<0.01）。微生物多样性研究发现，变形菌门(Proteobacteria)是栽培土壤、蔬菜的优势菌群；施加废水、猪粪能够显著改变土壤菌群结构，但对栽培蔬菜的菌群结构作用不显著。Network分析发现，梭菌属（Clostridium sensu stricto)为中心微生物，是9种ARGs和Int 1的共同潜在宿主，而sulII的潜在宿主菌最多。以上结果说明，养猪废水还田，能够改变土壤微生物菌群结构，促进土壤ARGs的积累，不同的ARGs能够借助潜在宿主菌而向蔬菜中迁移、蓄积，最终通过食物链进入人体，危害人类健康。本研究，为进一步评估ARGs对人类健康的潜在风险，控制ARGs的污染危害提供依据。