miRNA-140调控MSCs成软骨分化构建组织工程软骨的机制研究

关节损伤与疾病导致软骨缺损后自身修复能力缺乏，骨髓间质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)复合生物支架材料虽为其修复带来了希望，但干细胞定向分化的调控机制不明、支架材料的生物响应性欠佳、体外组织工程软骨的效能较低等问题制约了其应用。微小RNAs(microRNAs,miR)在转录后通过多基因靶向作用调控干细胞分化，我们的前期研究表明MSCs在成软骨细胞分化过程中miR-140的表达显著升高；并采用"胶原/纳米磷酸三钙"支架材料进行了兔膝关节全层软骨缺损的修复实验。基于上述基础，本课题拟采用慢病毒介导miR-140转染MSCs，复合双梯度双层一体"胶原/透明质酸/纳米磷酸三钙"支架材料，通过三维动态培养系统构建组织工程软骨，进行体内、外实验，探讨miR-140调控MSCs成软骨细胞分化构建组织工程软骨的机制，为组织工程软骨的应用提供理论依据和实验数据。

骨性关节炎（Osteoarthritis, OA）主要表现为软骨基质合成不足及关节软骨过度降解，软骨细胞在维持软骨基质合成和分解代谢平衡中发挥至关重要的作用。microRNA-140 (miR-140)是正常软骨中特异性表达的microRNA，发挥抗降解和促合成的双重作用。组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase 7, HDAC7)在人骨性关节炎软骨中能促进MMP-13的表达进而加速软骨基质降解。而Smads泛素化调控因子(SMAD Ubiquitination Regulatory Factor 1, Smurf1)则可通过介导BMP特异性R-Smads及BMP受体降解，影响软骨基质合成。本研究中，我们首先通过生物信息学分析预测到HDAC7和Smurf1的mRNA的3’UTR端含有miR-140功能序列的靶标序列，接着，通过临床样本检测，我们发现miR-140在膝OA患者的膝关节软骨磨损部位的表达水平较软骨相对完整部位明显降低，而HDAC7和Smurf1蛋白表达量则显著升高。进一步的体外荧光素酶报告基因分析证实：miR-140-5p可直接结合人OA软骨细胞中的HDAC7和Smurf1的mRNA的3’UTR端的靶标序列。接着，体外功能试验表明，抑制人OA软骨细胞内miR-140后 HDAC7与Smurf1的蛋白表达水平明显升高；相应的MMP-13的蛋白表达水平明显升高，而BMP通路特应性磷酸化Smad1/5/8的蛋白水平则明显下降。相反，在人OA软骨细胞内过表达miR-140后HDAC7与Smurf1的蛋白表达水平显著下降；相应的MMP-13的蛋白表达水平也显著下降，而磷酸化Smad1/5/8的蛋白水平则明显升高。另外，抑制人OA软骨细胞内miR-140后，collagen type II以及aggrecan的蛋白表达水平亦明显下降，而过表达miR-140后人OA软骨细胞内的collagen type II和aggrecan的蛋白水平明显升高。以上体外实验证据表明, miR-140在体外培养的人OA软骨细胞中既能抑制HDAC7从而影响软骨基质的分解，又能抑制Smurf1从而促进软骨基质的合成。研究结论为揭示膝骨性关节炎的病理生理过程提供了新的可能机制。由于经费限制，我们暂时未能对在体miR-140对关节软骨合成分解代谢的调控机制进行深入研究。