模拟细胞微环境强化干细胞体外定向预分化体系的研究及其工程化构建

Stem cell has great potential in the treatment of central nervous system diseases, but the efficiency of stem cell committed neural differentiation in vivo is very low, which limits the usability and safety of stem cell therapy. This project uses the differentiation of human-derived mesenchymal stem cell (MSC) into Nestin positive cells ex vivo as a model to investigate the synergetic effect of several important components of cellular microenvironment in vivo, including extracellular matrix (ECM)-derived peptides and stiffness, cell-cell interaction and mass transfer, on the stem cell committed pre-differentiation ex vivo and nervous function recovery in vivo, demonstrate the relationship between stem cell committed pre-differentiation ex vivo and tissue regeneration in vivo, and develop an optimized engineered mimic cellular 3D microenvironment system that can enhance stem cell committed differentiation ex vivo by means of ECM-derived peptide modified, stiffness controllable 3D biomimetic scaffold, 3D cell coculture and bioreactor.This system provides a engineered cellular microenvironment similar to native tissues in vivo with high mass transfer efficiency and standardized, large scale operation, which can generate lots of Nestin positive cells with high tissue regenerative ability and accelerate committed differentiation of stem cells and function recovery of damaged tissues in vivo after transplantation. In conclusion, this project uses engineered mimic cellular 3D microenvironment system to enhance the committed differentiation ex vivo and in vivo, which will provide a new strategy and method for stem cell therapy and regenerative medicine.

干细胞在治疗中枢神经系统疾病上具有巨大潜力，但是目前干细胞在体内的定向分化效率很低，限制了干细胞治疗的有效性和安全性。本项目以人源间充质干细胞向Nestin阳性细胞体外定向分化为模型，借助多肽修饰的、刚度可控的三维仿生支架、三维细胞共培养以及生物反应器，系统研究细胞外基质来源多肽和基质刚度、细胞之间相互作用以及质量传递等微环境重要因素对体外定向分化与神经功能修复的协同作用规律，揭示干细胞体外预分化和体内组织修复之间的关联，建立优化的工程化模拟细胞三维微环境强化干细胞体外定向预分化的新体系。此体系可为干细胞提供近似体内特异组织的微环境，具有传质效率高，可标准化、规模化操作的特点，可产生大量的、具有较高组织修复能力的Nestin阳性细胞，以促进移植细胞体内进一步定向分化和受损组织的修复。从而，本项目利用模拟细胞三维微环境体系强化干细胞体内外定向分化，为重建医学提供了干细胞治疗的新策略和新方法。

目前干细胞体内移植后向神经细胞定向分化的效率很低，在移植之前将干细胞进行向Nestin阳性细胞的预分化将有助于提高其在体内的神经分化效率，从而改善治疗效果。本项目根据体内神经组织微环境的构成特点，从细胞-细胞外基质相互作用、细胞-细胞之间相互作用及质量传递的角度出发构建了工程化模拟细胞微环境诱导干细胞体外向Nestin阳性细胞预分化的新体系，研究了神经组织细胞外基质重要成分、神经细胞共培养及流体流动对干细胞向神经细胞分化的协同作用规律，并通过体系优化来强化干细胞向Nestin阳性细胞预分化。本项目主要取得了以下重要进展：①开展了人脐带间充质干细胞质量控制研究，明确了体外长期传代培养对神经修复种子干细胞生物学特性的影响，发现培养后期干细胞的衰老及致癌基因表达显著提高，而培养中期向神经细胞定向分化效率则显著高于早期；②设计并制备了多肽修饰三维仿生支架，明确了神经组织细胞外基质来源多肽种类及含量对干细胞神经分化的影响，发现中等含量RGD多肽支架促进了干细胞向 Nestin阳性细胞的分化；③设计了硫酸软骨素修饰的仿生支架，明确了其修饰机制是依靠钙离子的配位反应，发现经过此种神经组织细胞外基质重要成分修饰后的支架显著促进了分化后神经细胞的增殖和活性；④发展了利用分子间相互作用精细调控支架降解的方法，建立了预测复合支架降解的数学模型，并研究了复合支架组成对干细胞生长的影响；⑤发展了提高三维支架孔隙率的新方法，通过改变界面反应速率改善支架的传质，促进分化后神经细胞的增殖；⑥利用优化的仿生支架、细胞共培养及生物反应器建立了工程化半三维及全三维模拟神经组织微环境体系，研究了细胞之间比例、流体流动等重要参数对神经分化的作用规律，并通过多参数协同来强化干细胞体外向Nestin阳性细胞预分化。总之，本项目通过在体外建立能够模拟在体神经组织细胞微环境的新体系来强化干细胞向Nestin阳性细胞的预分化，从而为再生医学提供了调控干细胞定向分化的新策略和新技术。