成分明确的人诱导多能干细胞体外成骨分化微环境构建及分子机制研究

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), which are a type of pluripotent stem cell that can be generated directly from adult cells, hold great promise in the field of regenerative medicine. However, the safety issues, derived from the employment of matrigel, gelatin, or serum during the generation, maintainance, and differentiation of hiPSCs become the tough challenge and bottleneck constraint for the potential clinical applications of hiPSCs. We have developed aA culture surface decorated by polydopamine-carboxymethyl chitosan-VN peptide has been developed in our lab in recent years, which could support the proliferation and self-renewal of hiPSCs originated from different germ layers. In the present studyproposed research, we will investigated the in vitro and in vivo osteogenic differentiation of hiPSCs under the BFP-1 peptide and dexamethasone-encapsulated lipidosome decorated surface combined with the optimized chemically defined osteogenic inducing medium. We aimedThe goal is to establish a safe, efficient, and fully chemically defined osteogenic microenvironment for hiPSCs, and to acquire osteoblast-like cells which hold great potential in clinic applications. Transcriptomic alteration, DNA methylation and histone modification of osteogenesis-related genes was will be further probed to explore the underlying mechanism of osteogenic differentiation of hiPSCs on the BFP-1 peptide and dexamethasone-wrapped lipidosome conjugated surface.

在人诱导多能干细胞体外重编程、自我更新和成骨分化研究中，存在使用Matrigel、明胶和动物血清等引起的安全性问题。本课题拟在已成功构建的聚多巴胺-羧甲基壳聚糖-VN多肽表面上获得不同胚层来源的人诱导多能干细胞，通过体内体外实验着重研究经聚多巴胺共价接枝BFP-1多肽和载地塞米松脂质体修饰的表面，结合成分明确诱导骨分化培养基筛选或优化，以及胚层来源对人诱导多能干细胞成骨分化能力的研究结果，构建成分明确且安全高效的人诱导多能干细胞成骨分化微环境，力争获得具有临床应用前景的成骨样细胞。采用转录组学方法，研究在BFP-1多肽和载地塞米松脂质体修饰的培养表面上，人诱导多能干细胞成骨分化不同时期mRNA表达水平的变化；通过表观遗传学研究该过程中成骨相关基因的DNA甲基化和组蛋白修饰的变化，揭示BFP-1多肽和地塞米松影响hiPSCs成骨分化的分子调控网络，深入认识人诱导多能干细胞成骨分化的分子机制。

人诱导多能干细胞（hiPSCs）是骨组织工程中理想的骨再生种子细胞来源之一，其在体外重编程、自我更新和成骨分化研究中，存在安全隐患和分化效率低下的问题，因此，构建成分明确、安全可靠、分化效率高的人诱导多能干细胞成骨分化微环境，对骨组织工程具有重要的理论意义和临床应用价值。在获得不同胚层体细胞来源hiPSCs的基础上，本项目从成骨向诱导分化起始条件的研究、促成骨小分子对人诱导多能干细胞成骨分化的影响、构建成分明确的功能化成骨向诱导分化体系三个方面入手，较系统地对影响hiPSCs体外成骨向分化的相关因素进行了研究。首先，分别研究了目前常用的拟胚体诱导法和单层诱导法的起始条件。证实通过拟胚体法进行hiPSCs成骨向诱导分化，拟胚体悬浮3-5天钙盐沉积量最多，成骨分化效率较高。利用单层法诱导hiPSCs成骨向分化，起始分化密度为80%时能获得较多的成骨样细胞。然后，为了确定多种具有促成骨功能小分子的最佳作用时间段，分别在0-7天、7-14天、14-21天、21-28天和0-28天在培养基中添加BFP1多肽、BMP2蛋白和β-巯基乙醇，并利用RT-PCR、免疫荧光染色、茜素红染色等实验评价成骨分化效率。 结果显示BFP-1多肽的理想添加时间段是7-14天；成骨分化0-7天添加β-巯基乙醇会促进胶原的形成；在成骨分化的不同时间段添加BMP2都会促进钙结节的形成。再然后，证实E6+TGFβ1培养基是理想的hiPSCs成骨分化拟胚体培养基，MSC-SFM培养基适于hiPSCs拟胚体继续成骨向诱导分化，初步构建了成分明确的hiPSCs体外成骨向诱导体系，但分化效率仍有待提高。此外，课题组成功将hiPSC悬浮5天的拟胚体细胞消化为单细胞，且获得了理想的存活率。目前，课题组将载地塞米松和BFP-1多肽脂质体成功修饰在聚多巴胺涂层表面，将hiPSC拟胚体单细胞在该功能化表面贴壁，使用成分明确的成骨诱导培养基正在进行成骨向诱导分化实验，从而构建成分明确的具有促成骨向分化功能的hiPSC体外分化体系。这些结果将促进人诱导多能干细胞在骨组织工程基础研究和临床治疗中的应用。