动态共培养调控干细胞体外定向分化新体系的构建与研究

干细胞体外三维定向分化为特定组织能够加速体内受损组织的修复，并提高临床的安全性。体细胞和干细胞的共培养体系可以模拟体内生长微环境，促进干细胞的体外定向分化。共培养体系中两种细胞之间的作用距离和作用时间是调控干细胞分化的关键因素，而目前它们的作用规律还不明确，尤其缺乏可有效控制作用距离和时间的动态共培养体系，这直接影响了干细胞修复体内大尺寸受损组织的效果。本项目在研究两种细胞间作用距离和作用时间调控干细胞分化规律的基础上，构建了基于旋转式生物反应器、三维支架和微胶囊技术的动态共培养调控干细胞体外三维定向分化为特定组织的新体系。此体系通过调整微囊膜厚度和反应器旋转速率等参数可以实现微囊内体细胞和支架中干细胞之间的近距离持续相互作用，具有传质效率高、易于去除体细胞等特点，且利用此体系所构建的三维组织可加速动物体内大尺寸骨组织缺损的修复，从而为再生医学提供了一种调控干细胞定向分化的工程学新方法。

本项目以干细胞体外定向诱导分化为研究对象，借助于生物微胶囊、细胞共培养、磁分离以及生物反应器等技术构建了可模拟体内特异组织微环境的工程化动态细胞共培养调控干细胞体外定向分化的新体系，研究了干细胞和诱导细胞之间作用距离、作用时间及数量比例、干细胞二/三维生长方式以及流体流动等关键因素对干细胞体外定向分化效果的作用规律，主要取得了以下重要进展：①通过实验及数学模型研究证明了静电微囊化过程对诱导细胞的代谢活性、增殖、粘附、凋亡以及功能等生物学行为没有显著影响，优化的微囊制备条件为囊膜厚度10-15 µm，微囊粒径约400 µm，在此条件下微囊具有足够的囊膜强度和溶氧渗透性，避免了内部细胞的渗漏和乏氧，并发现内部诱导细胞保持了良好的生长状态和具有类似体内的相关功能。②微胶囊可作为多种细胞共培养的新型隔离手段，微胶囊膜避免了不同类型细胞之间的相互污染，而微囊化诱导细胞分泌的复杂可溶性因子则可透过微胶囊膜显著促进外部干细胞向成骨细胞、神经前体细胞等特异类型细胞体外定向分化，并发现细胞之间的比例以及相互作用时间显著调控了干细胞分化的效果。③建立了研究两种细胞之间距离对细胞之间相互作用影响的新方法，发现干细胞与诱导细胞之间的距离影响了两种细胞之间的旁分泌作用，进而导致了干细胞定向分化效果的差异，发现促进干细胞向神经前体细胞体外定向分化的较佳作用距离为350μm左右。④发现四氧化三铁磁性颗粒安全性好，进而发展了磁分离式细胞三维共培养方法，含有此颗粒和诱导细胞的微胶囊在外加磁场作用下可彻底去除，从而解决了含不同类型细胞三维微球支架的分离问题。⑤旋转生物反应器的流体流动提高了包埋在不同三维支架内部的诱导细胞和干细胞之间的相互作用，增强了体系中可溶性因子的质量传递，干细胞的定向分化效果较之静态共培养有所提高。从而，本项目揭示了细胞共培养体系关键因素的作用机制，利用工程化原理与技术所构建的动态细胞共培养诱导体系为实现体外大规模干细胞定向分化调控提供了新思路和新方法，有助于推进干细胞的基础研究与临床应用。