Lycorine上调p53非依赖的p21转录机制及生物学效应研究

申请者前期研究发现天然活性化合物lycorine具有抗白血病的效应，能够显著上调HL-60细胞中p21表达，鉴于p53在HL-60中缺失，故HL-60中p21的表达受到p53非依赖的途径调控。申请者拟在HL-6O细胞中从转录调控水平深入开展lycorine上调p21的机制研究。研究在lycorine干预下，p21上游的主要信号途径Sp1/Sp3、Myc、Rb/E2F对p21转录活性的调节情况；Lycorine对HDACs及RNA聚合酶II的表达影响；阐明lycorine阻滞周期的分子机制，明确lycorine是否导致白血病细胞发生衰老。利用RNAi明确p21是lycorine作用的关键分子靶标。通过本研究深入阐明lycorine作用的分子机理，探求lycorine作用的关键靶分子，为从天然活性化合物中筛选新型抗白血病药物提供完善的实验数据，具有源头创新性和较强的应用价值。

Lycorine是从我国广泛分布的多年生草本植物石蒜鳞茎中分离出的一种单体化合物，属于异喹啉类(isoquinoline)生物碱，申请者前期研究发现天然活性化合物lycorine具有抗白血病的效应，能够显著上调HL-60细胞和k562细胞中p21表达，鉴于p53在HL-60中缺失，在k562细胞中p53是野生型的，故本研究以HL-60细胞和k562细胞为模型，研究lycorine上调p21的可能信号途径。通过Western blotting检测lycorine作用后p53蛋白的表达变化及调控p21转录相关蛋白：E2F、Rb、pRb和c-myb的表达变化。结果发现，在k562细胞中，随着lycorine的增加，p53表达没有变化，表明lycorine对p21的调控是p53非依赖的。随着lycorine药物作用浓度的逐渐增大，HL-60细胞中Rb表达上调，而k562细胞中的Rb表达量基本不变，而pRb均下降；E2F蛋白表达量均上调；c-myc蛋白表达量均下调。通过HDAC活性比色分析试剂盒检测lycorine作用后HDAC的活性，发现lycorine不影响HL-60细胞中HDAC的活性而下调k562细胞中HDAC的活性，进一步我们深入研究了lycorine抑制k562细胞增殖的分子机制和细胞效应；另外，为检测p21效应分子的特异性，以p21 siRNA封闭p21基因的表达后，用lycorine干预p21封闭前后的细胞，采用流式细胞术检测p21封闭后的细胞凋亡变化。结果发现，p21 siRNA +lycorine组细胞凋亡百分率较阴性序列+lycorine组有明显减少，表明p21是lycorine重要的效应靶分子。通过本研究深入阐明lycorine作用的分子机理，探求lycorine作用的关键靶分子，为从天然活性化合物中筛选新型抗白血病药物提供完善的实验数据，具有源头创新性和较强的应用价值。