基于PAL-ABPP探针的四环素受体的制备及其分子识别机制研究

The receptors derived from the organism have a feature of recognizing the special substrates and will be able to replace the antibody to resolve the problem which restricts the development of multi-residue immunoassays for veterinary medicine. In this project, the tetracycline repressor protein (TetR) of the tetracycline resistance bacteria is selected as the target. Firstly, the Photoaffinity Labeling-Activity Based Protein Profiling (PAL-ABPP) probe will be linked with tetracycline by chemical synthesis method, and then the probe will be used to isolate and extract natural TetR directly from the tetracycline resistant bacterial strains as the tetracycline specific receptor. Secondly, the physical and chemical properties of the obtained receptor such as amino acid composition, molecular weight, three dimensional structure, stabilization and specificity will be characterized by using proteomics, bioinformatics, mass spectrometry, X-ray diffraction and immunoassay methods. And what’s more, the crucial amino acids of this receptor and their relationship with the affinity when it recognizes and bonds with the tetracyclines will be studied by homology modeling, molecular docking, amino acid mutation technique and competitive ELISA method, and meanwhile a multi-analyte immunoassay for the determination of tetracyclines residues will be established based on these. At the end, the specific receptor of tetracycline will be yielded, and the results of this project will illuminate its interactional molecular mechanism with the tetracyclines and provide a novel strategy for production, molecular mechanism study and establishment of residue immunoassay of the receptors of other compounds.

来自于生物体的受体具有识别特异性底物的特点，可以代替抗体解决制约动物源性食品中兽药多残留快速检测方法发展的问题。本项目以四环素阻遏蛋白（TetR）为研究目标，通过化学合成法制备四环素的光亲和标记活性蛋白谱探针（PAL-ABPP-四环素探针），用探针从耐四环素细菌内直接获取天然TetR作为四环素受体；再利用蛋白质组学、生物信息学、质谱、X-射线衍射、免疫分析等方法对该受体进行分析鉴定，确定其氨基酸组成、三维结构、稳定性、特异性等理化性质；并将同源模拟、分子对接、氨基酸突变技术与竞争ELISA方法相结合，研究TetR结合四环素类药物时的关键氨基酸及它们与亲和力的关系，以此为基础建立四环素类药物多残留快速检测方法。研究结果将获得四环素特异性受体并解析其与四环素类药物相互作用的分子机制，从而为其他小分子物质特异性受体的制备、分子识别机制研究和免疫学残留检测方法的建立提供全新的思路和依据。

受体蛋白作为一种新型的识别元件可用于免疫残留检测。本研究利用大肠杆菌表达系统和PAL-ABPP、ABPP探针分别制备了能够特异性识别四环素类药物（TCs）的TetR蛋白，分析了其与TCs的分子间作用机制，并建立了基于重组TetR、突变进化TetR和天然TetR的动物性食品中四环素类药物残留的免疫学检测方法。首先，以分子生物学方法构建了重组表达载体pET32a-TetR，转化E.coli Rosetta-gami（DE3），经诱导表达纯化获得重组TetR，据此建立了一种化学发光免疫分析法可用于检测牛奶中TCs；并且通过分子对接技术发现其与5种TCs的分子间相互作用力主要是疏水作用和π-π键，而D环是四环素分子中主要的受体结合位置。在此基础之上，通过理论计算和点突变的方法对TetR进行了定向进化，获得了两个突变体Pro105Phe和Pro105Tyr，并比较了它们与9种TCs的识别机制，确定了提供相互作用力的氨基酸数量增加；因此，突变体对四环素类的亲和力和灵敏度都有提高，与亲本TetR相比，敏感性提高了1.5-13.3倍；利用其中之一建立了一步竞争荧光免疫分析法，可用于测定鸡蛋中TCs的残留量，9种药物的IC50范围为3.1-17.2ng/mL、LOD为0.3-5.8ng/mL，并且该方法的检测过程简单、快速。此外，利用设计合成的PAL-ABPP探针和ABPP探针探针从细菌裂解液中提取纯化获得了天然TetR，并建立了用于牛奶中四环素类药物的免疫化学发光检测方法，确定了优化试验条件为50 mmol/L鲁米诺、10 mmol/L H2O2和20 mmol/L IMP，对10种药物的IC50值的范围是0.084-0.32 ng/mL、LOD范围为2.0-9.0 pg/mL。通过比较发现，天然TetR比之前的TetR的识别能力更好。所开发的化学发光法可作为一种快速、简单、灵敏的方法用于常规筛选牛奶样品中的TCs残留。本研究中不同的TetR制备方法为其他受体蛋白或酶的制备提供了理论参考和试验方法，所建立的三种方法为开发其他药物的免疫学残留分析方法提供了借鉴。