脂筏在西妥昔诱导胃癌细胞发生保护性自噬中的作用及调控机理研究

抗EGFR单抗西妥昔联合化疗对KRAS基因野生型结直肠癌具有显著的疗效。胃癌是我国的高发肿瘤，单纯化疗效果不理想。绝大多数胃癌表达EGFR，并且KRAS基因突变率很低，小样本临床研究也证实，西妥昔联合化疗对晚期胃癌可以提高疗效，但部分患者对西妥昔耐药。最新研究表明，西妥昔诱导的保护性自噬是导致耐药的重要原因，抑制保护性自噬可能是克服西妥昔耐药的重要手段。我们在前期研究中发现，西妥昔诱导胃癌细胞发生保护性自噬的同时可募集位于细胞膜的脂筏，泛素连接酶Cbl-b是重要的脂筏抑制因子，敲除Cbl-b的细胞脂筏募集明显，且自噬反应增强。这些研究结果提示脂筏可能是西妥昔激活自噬的重要平台，Cbl-b可能通过抑制脂筏介导的自噬逆转西妥昔耐药。本项目拟进一步研究Cbl-b抑制脂筏的确切机制及其对西妥昔诱导的保护性自噬的调控作用。研究结果将为明确西妥昔耐药机理和自噬的调控机制提供科学依据。

一、研究背景及方向：研究表明自噬参与了多种抗肿瘤药物的耐药过程，西妥昔诱导的保护性自噬是导致耐药的重要原因。前期研究结果提示脂筏可能是西妥昔调控自噬的重要平台，Cbl-b 可能通过调控脂筏介导的自噬逆转西妥昔耐药。本项目进一步研究Cbl-b 抑制脂筏的确切机制及其对西妥昔诱导的保护性自噬的调控作用。.二、主要内容：明确在胃癌细胞中，西妥昔诱导保护性自噬拮抗其抗肿瘤作用的机理；明确脂筏在自噬中的作用及其分子机制；明确Cbl-b如何通过调控脂筏进而调控自噬。.三、重要结果及关键数据： .1.研究明确了西妥昔诱导胃癌细胞发生保护性自噬，促进脂筏聚集，抑制了自噬可增强细胞对西妥昔的敏感性。在此基础上，发现中药β-榄香烯对胃癌、非小细胞肺癌及肾细胞癌均有很好的抗肿瘤作用，并且可诱导自噬反应，抑制自噬可明显增强β-榄香烯的抑制增殖和诱导凋亡作用。此外还发现奥沙利铂，三氧化二砷，bufalin等也可诱导细胞发生保护性自噬，抑制自噬可增强药物的抗肿瘤活性。.2.明确自噬和脂筏的关系：采用去血清饥饿诱导自噬反应可募集脂筏； LC3-II主要分布在脂筏层内，强烈提示脂筏是自噬发生的关键场所；应用脂筏抑制剂抑制脂筏募集可明显增强饥饿诱导的自噬反应；采用siRNA干扰Cav-1的表达可增强饥饿诱导的自噬反应。这些研究结果提示脂筏及Cav-1在自噬反应当中发挥重要作用。.3.Cbl-b对自噬的调控作用：三氧化二砷可上调Cbl-b的表达，Cbl-b通过与FLIPL共结合，降解FLIPL，诱导自噬反应发生，首次阐明了泛素连接酶Cbl-b可诱导自噬。采用shRNA敲除Cbl-b蛋白后，在饥饿诱导下，敲除Cbl-b的细胞饥饿诱导的磷酸化ERK及AKT均减弱，自噬反应减弱，提示Cbl-b可能通过调控信号转导进而促进自噬反应方式。利用免疫共沉降技术，发现Cbl-b与PI3K的 III类激酶Vps34存在共结合，提示Cbl-b可能在自噬的起始阶段通过与Vps34相互作用参与自噬发生。.四、科学意义：研究结果发现自噬是抗肿瘤制剂诱导细胞凋亡过程中的普遍现象，提示研究自噬对凋亡的调控机理十分必要。研究成果阐述了Cbl-b通过调控一系列信号转导分子表达和功能，进而抑制脂筏，促进自噬反应，提示恶性肿瘤信号转导异常对生物学行为有重要影响，为研究恶性肿瘤耐药机理及逆转提供了理论依据。