苏尼替尼诱导p53自噬-溶酶体降解的调控机制及生物学效应研究

p53 is one of the most important tumor suppressor proteins, whose stability plays a role in the development and maintenance of cancer. Thus to maintain the stability of p53 is considered as one of the effective strategies in the treatment of cancer. In cancer cells, p53 protein, with a short half-life, is mainly degraded via the ubiquitin-proteasome pathway. However, after the cancer cells were treated with sunitinib, we found that p53 protein in the cells was degraded through the autophagy-lysosomal pathway, which is a novel degradation pathway for p53. Our preliminary data showed that p53 N-terminal phosphorylation and the upregulation of HMGB1 participated in the autophagy-lysosomal degradation of p53 induced by sunitinib. On the basis of these observations, this project will focus on the novel degradation pathway of p53, to clarify its molecular mechanisms and biological effects. We aim to explore the roles of the expression of HMGB1 and p53 phosphorylation in the autophagy-lysosomal degradation of p53, to elucidate the possibility of HMGB1 as a novel molecular target to enhance the anticancer efficacy of sunitinib. Obviously, all these efforts will not only benefit for the exploration of the novel regulation pathway of p53 and the molecular mechanisms of this process, but also aid in the discovery of bio-markers and effective strategies to improve the clinical applications of sunitinib.

p53作为重要的抑癌蛋白，其稳定性与肿瘤的发生发展密切相关，维持p53稳定被认为是治疗肿瘤的重要策略之一。在肿瘤细胞内，p53蛋白的半衰期非常短，主要通过泛素-蛋白酶体通路发生降解。我们发现在苏尼替尼作用下，p53可通过自噬-溶酶体通路发生降解，这种全新降解方式的生物学意义有待进一步研究。本课题前期研究发现p53氨基端磷酸化水平的降低及HMGB1表达水平的上调参与了p53自噬-溶酶体降解的过程，在此基础上，我们将进一步明确通过自噬-溶酶体途径这一p53蛋白全新的降解方式，探索HMGB1及p53磷酸化调控在其中发挥的作用，阐明p53自噬-溶酶体降解的调控机制，确证HMGB1作为提高苏尼替尼抗肿瘤活性潜在靶点的可行性。通过本项目的实施，不仅能够发现p53蛋白水平调控的新机制，明确该过程中的关键环节，而且为提高p53稳定性及苏尼替尼抗肿瘤活性提供全新的策略，具有很高的理论价值和应用前景。

我们前期研究发现苏尼替尼可诱导野生型p53发生自噬-溶酶体依赖的降解。p53作为一个非常重要的抑癌蛋白，能够通过多种作用机制发挥抗肿瘤活性。p53的稳定性与肿瘤的发生发展密切相关，因此研究维持p53稳定的策略一直是肿瘤学界的热点之一。目前普遍认为p53经由泛素-蛋白酶体通路发生降解，而突变型p53亦可通过自噬溶酶体通路降解。基于此，本课题将进一步明确野生型p53通过自噬-溶酶体降解途径这一全新降解方式，确证HMGB1在其中的关键调控作用。.研究中，我们发现苏尼替尼会明显激活自噬，并使p53蛋白呈时间、剂量依赖性的下调。继而我们发现苏尼替尼均会下调多株癌细胞株以及正常细胞的p53蛋白，并且这种下调作用依赖于自噬-溶酶体通路。随后，我们发现苏尼替尼明显促进p53聚集体的形成、与p62的共定位，且苏尼替尼促进p53聚集体与自噬关键蛋白p62的相互作用。苏尼替尼作用后p53发生明显的核输出。并且在p53敲除的细胞株中过表达野生型与NES突变型p53，发现苏尼替尼诱导的p53的核输出以及降解不依赖于其本身的核输出信号。而HMGB1很有可能参与苏尼替尼诱导的p53的核输出与降解。HMGB1敲除以后，苏尼替尼诱导的p53的核输出及降解会被显著逆转。而过表达野生型HMGB1质粒明显促进苏尼替尼诱导的p53的降解。这些发现证明HMGB1的核输出在苏尼替尼诱导的p53的降解中扮演着重要的作用。我们在体外通过SRB检测干预自噬或者沉默HMGB1以后苏尼替尼对结肠癌细胞的增殖抑制作用，在体内构建HCT116(Wt，Mis，2# shRNA)裸小鼠移植瘤模型考察苏尼替尼的抗肿瘤活性。实验结果发现自噬阻断可明显增强苏尼替尼的癌细胞增殖抑制作用，并且HMGB1沉默效率与苏尼替尼抗肿瘤活性呈明显的正相关关系。沉默HMGB1以后苏尼替尼对结肠癌细胞体内和体外抗肿瘤活性均明显提升，且HMGB1沉默效率与苏尼替尼抗肿瘤活性呈明显的正相关关系。.因此我们的研究发现了苏尼替尼调控p53的全新方式，而且为提高p53稳定性提供全新的策略，为肿瘤化疗新方案设计提供理论依据，具有很高的理论价值和应用前景。