糖尿病中乙酰化/琥珀酰化对TFAM调控机制研究

Mitochondrial dysfunction is a key mechanism in the pathogenesis of diabetes. TFAM is responsible for the replication and transcription of mitochondrial DNA, so as to maintain the mitochondrial DNA copy number and transcriptional level. In diabetes, the protein level of TFAM is dramatically reduced, however, its mRNA level is compensating elevated rather than decreased, indicating that protein posttranslational modification (PTM) plays a key role in regulating the protein stability of TFAM. Mass spectrum studies showed that TFAM can be modificated by acetylation and succination, and mitochondria-located SIRT3 and SIRT5 might participate in those PTMs, respectively. In this study, we will determine the acetylation and succination sites by using mass spectrum, screen candidate enzyme for those PTMs using molecular and biochemical assays, for the purpose of exploring the impact of PTMs, including acetylation and succination, on controlling the protein stability and replication/transcription function of TFAM, as well as the role of this pathway in the pathogenesis of diabetes.

线粒体功能紊乱是糖尿病发病机理中的关键机制。TFAM负责线粒体DNA的复制及转录，维持正常的线粒体DNA数目及转录水平。糖尿病中，TFAM蛋白水平显著降低，而其mRNA水平没有变化甚至补偿性地升高，提示翻译后修饰对其蛋白质稳定性调节的重要作用。质谱分析显示TFAM可以发生乙酰化和琥珀酰化等翻译后修饰，而定位于线粒体的去乙酰化酶SIRT3和SIRT5可能分别参与到这两种修饰当中。本研究拟通过质谱分析确定TFAM的乙酰化及琥珀酰化位点，使用分子与生化方法筛选参与其中的修饰酶，探索乙酰化及琥珀酰化翻译后修饰对TFAM蛋白质稳定性及其复制/转录功能的调节机制，以及该调节在糖尿病发病机制中的作用。

基于我们前期发现，在糖尿病/胰岛素抵抗条件下，线粒体的蛋白及线粒体DNA含量均显著降低，负责线粒体DNA复制转录的转录因子TFAM的蛋白水平也显著降低，但是TFAM的转录水平反而是升高的，提示TFAM蛋白质的降低并非由转录水平引起，其稳定性在糖尿病/胰岛素抵抗中发生改变。在本研究项目中，我们从蛋白质翻译后修饰角度入手，探索糖尿病发病过程中对TFAM蛋白质稳定性和复制/转录功能的调节机制。我们发现，TFAM蛋白本身受到乙酰化修饰调节，而该乙酰化修饰主要发生在其主要结构域的连接区域中的第131为赖氨酸。TFAM乙酰化修饰由P300乙酰化酶催化完成，而定位于线粒体的去乙酰化酶SIRT3则负责其去乙酰化过程。另外，我们还发现，乙酰化对TFAM蛋白质稳定性调节具有重要作用，模拟去乙酰化修饰的TFAM-K131R突变引起TFAM蛋白质稳定性下降。更重要的是，在多种糖尿病模型动物中（包括db/db，ob/ob及高脂饮食诱导的糖尿病），TFAM蛋白水平显著降低，而且TFAM蛋白乙酰化修饰水平也发生明显降低。而通过TFAM-K131R突变模拟去TFAM乙酰化过程，引起显著的胰岛素抵抗效应。综上所述，乙酰化修饰在TFAM蛋白质稳定性调节中发挥重要作用，而TFAM乙酰化修饰的降低，引起胰岛素抵抗和糖尿病发生，提示靶向恢复TFAM乙酰化水平可以成为改善胰岛素抵抗和治疗糖尿病的靶点。