应用高场核磁共振技术针对BTK激酶与不可逆抑制剂的不同药效作用的结构机制研究

BTK kinase is one of the most important and validated drug discovery targets for B-cell lymphoma. In Nov. 2013 and Feb. 2014, USFDA approved irreversible BTK inhibitor Ibrutinib (PCI-32765) for the clinical use against mantle cell lymphoma (MCL) and chronic lymphocytic leukemia (CLL), respectively. Recently we have developed an irreversible BTK kinase inhibitor QL47 that presumably shares a similar mechanism with Ibrutinib by irreversibly forming a covalent bond with Cys481 located in the hinge binding area of the ATP binding pocket. However, we found that their pharmacological effects are quite different regarding to the autophosphorylation of BTK in vitro, effect of the blockage of BTK downstream signaling, anti-proliferative effect of B-cell malignant cell lines and the anti-proliferation effect on the patient derived primary cells. By excluding other kinase mediated off-target effects, we envisioned that one of the most possible reasons for this difference may be due to the different conformational change induced by the drug binding and subsequent covalent bond formation. NMR is one of the most suitable techniques for such study. Therefore, we plan to use the high magnetic field NMR methods, combing with the molecular biology and chemical biology techniques, to explore its mechanism from the structural point of view, which will help us to further interpret the role of BTK dysregulation in B-cell lymphoma and pave the way to develop next generation BTK kinase inhibitor drugs.

BTK激酶是治疗B细胞淋巴瘤的一个重要靶点。近来美国FDA已经批准了BTK激酶抑制剂Ibrutinib用于套细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的治疗。我们前期开发了一个与Ibrutinib作用机制相同的BTK激酶不可逆抑制剂QL47, 尽管两者都通过与BTK激酶中的Cys481形成共价键而发挥药效，但是其作用效果在BTK蛋白自磷酸化、对细胞内BTK的下游信号通路影响、癌症细胞系增殖抑制以及病人的原代细胞增殖抑制上却有很大的差异。通过广泛的前期探索，我们认为这极有可能是由于不同药物与BTK激酶发生作用后所引起的不同构象变化而产生的，而核磁共振技术是研究此类蛋白动态变化的首选手段。因此，我们拟通过高场核磁共振结构生物学的方法，结合分子生物学等多种研究手段，从结构变化的角度探究这些药效差异的机理，为进一步揭示BTK激酶及其信号通路在B细胞淋巴瘤中的作用以及开发新的BTK激酶靶向药物提供理论依据。

BTK激酶是治疗B细胞淋巴瘤的一个重要靶点，我们在针对BTK激酶抑制剂的研发中发现了一个与依鲁替尼（Ibrutinib）作用机制相同的BTK激酶不可逆抑制剂QL47。在探讨该化合物与依鲁替尼等BTK抑制剂的药效差异的过程中，我们发现QL47在细胞抗增殖实验筛选中对于FLT3-ITD突变型的急性白血病（AML）细胞具有很强的抑制活性，而我们之前的研究显示敲除BTK对于FLT3-ITD突变的细胞增殖没有明显的抑制作用，因此我们推测QL47可能具有其他的靶点。通过对信号通路影响的检测，我们发现FLT3蛋白在QL47的作用下能够发生降解。而采用分子探针QL47-biotin以及质谱鉴定的研究手段，我们发现QL47能够不可逆结合于热休克蛋白HSP70的Cys267位点，能够影响HSP70的蛋白重折叠功能，进而导致HSP70的客户蛋白FLT3发生降解, 抑制下游的STAT5-MYC信号通路，从而体现了良好的对于FLT3突变的白血病细胞系的抗增殖效果。同时HSP70在肿瘤细胞内起到重要的抗凋亡作用，抑制HSP70能够导致抗凋亡因子XIAP的降解，进而导致细胞凋亡的发生，并且能够将细胞周期阻滞在G0-G1期。QL47虽然结合于HSP70的ATPase结构域，但是却对其ATPase活性没有抑制，这表明QL47与HSP70的结合方式有别于传统的HSP70抑制剂VER155008，是一种新型的HSP70抑制剂。这一研究揭示了QL47不同于其他BTK激酶抑制剂的药效机理，同时也为新型HSP70抑制剂的研发提供了理论及结构基础，为FLT3-ITD突变的急性白血病的治疗提供了新的策略。目前标注本资助项目编号的相关科研成果已发表SCI论文8篇，并培养毕业博士研究生3名和硕士研究生1名。