E-Cadherind蛋白基质化海藻酸微胶囊三维微环境构建及其对诱导胚胎干细胞向肝细胞定向分化影响机制的研究

本项目旨在改善胚胎干细胞（ESCs）非均质拟胚体结构及其自分化对ESCs向肝细胞定向分化诱导的不良影响，探索半乳糖化海藻酸微囊中细胞间结合蛋白上皮细胞钙粘素（E-Cadherin）基质化构建细胞外微环境，促进体外培养ESCs形成E-Cadherin介导的均质拟胚体结构；考察并优化其微环境与肝细胞定向分化诱导因子的协同作用，开发ESCs源肝细胞批量制备技术。开发E-Cadherin/半乳糖生物活性基团基质化修饰技术、调控水凝胶浓度、交联度及诱导因子组合等微环境因素，考察其对ESCs增殖、拟胚体形成、向肝细胞定向分化及肝功能表达的影响，从蛋白和基因水平揭示E-cadehrin/半乳糖修饰海藻酸微囊微环境构建规律和其促进诱导ESCs向肝细胞定向分化的分子机制。其对进一步推进诱导性多能干细胞（iPS）的个体化应用研究和肝脏再生医学相关领域的临床及基础研究将具有重大的理论和实践指导意义。

本项目设计开发仿细胞间相互作用的细胞外基质材料并构建仿生细胞外微环境，旨在改善干细胞的体外增殖及肝定向分化。本研究中，我们通过基因工程技术及真核细胞表达系统生物合成了人免疫球蛋白IgG-Fc与人源上皮细胞钙粘素的融合蛋白（hE-Cad-Fc），Elisa和western blotting检测表明我们成功制备了高纯度的hE-cadherin-Fc；该融合蛋白被应用于疏水材料表面修饰，构建了仿细胞-细胞间相互作用的细胞外微环境，其用于了人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的增殖及定向分化研究。结果表明：通过Fc结构域的疏水结合，hE-cadherin-Fc能够稳定的吸附在疏水材料表面，显著改善材料表面的形态及亲水性，并形成稳定的仿细胞间相互作用的细胞外基质，显著改善二维及三维（类拟胚体及支架）体外培养干细胞的增殖与其肝定向分化。hE-cadherin-Fc基质对hMSCs生物学行为的调控及其分子机制研究表明，hE-cadherin-Fc基质显著提高了hMSCs的E钙粘素信号通路相关分子的表达水平，初步揭示了在细胞培养初期hE-cadherin-Fc基质与细胞间的相互作用代替了细胞-细胞间的相互作用；同时，hE-cadherin-Fc基质具有与相关液性因子协同作用促进hMSCs向肝细胞定向跨胚层分化的潜能，其分子机制还有待进一步深入研究。另一方面，为了改善三维培养及细胞聚集体(类拟胚体）内微血管的新生，我们同时研制了人血管内皮细胞生长因子与IgGFc的融合蛋白（hVEGF-Fc），且研究表明hVEGF-Fc基质化可显著改善内皮细胞的增殖及分化功能表达。该研究不仅为新型生物材料开发及其对干细胞增殖与分化调控研究奠定了一定的理论和实践基础，并展示了融合蛋白生物材料在再生医学领域的应用前景。