多孔聚合微球包埋rhBMP-2及复合骨髓间质干细胞对脊柱融合的作用研究

Autogenous bone graft is allways the golden standard for treatment with bone defect caused by spine malformation,trauma, bone tumor,etc require bone transplantation or bone substitution. A modified water-in-oil-in-water (W1/O/W2) double emulsion solvent evaporation and gas foaming method is employed for producing the poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) microspheres. The PLGA microspheres diameter is 510nm by average, and encapsulating rate is 60%, 90% of drugs deliveried over 30 days.Then in the condition of open porous microspheres scaffolds culture systems in vitro, the effect of proliferation, differentiation and bone formation of BMSCs will be analyzed by the control of rhBMP-2-porous microsphere and simply administering rhBMP-2. Combination rhBMP-2-porous microspheres and BMSCs-porous microspheres will be used for posterolateral spine fusion in SD rats. The animals that showed radiographic evidence of healing will be killed four weeks after operation and will be examined with plain radiographs, manual palpation, Micro computed tomography scanning, and histological analysis.Then we can evaluate the feasibility of the open porous PLGA microspheres used as bone transplantation for spinal fusion, and we also can explore the mechanism of action.

自体骨移植是治疗脊柱畸形、创伤及肿瘤等疾病后，获得脊柱骨性融合的"金标准"，但植骨融合失败率仍较高。我们将聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）用复乳发泡法制备包埋rhBMP-2的可降解聚合多孔微球。首先，作为rhBMP-2的缓释载体，预实验显示其平均包封率为60%，30天累计释放可达90%，可以满足成骨过程的需要；再者，将多孔微球同骨髓间质干细胞(BMSCs)体外共培养，观察并检测BMSCs的粘附、增殖和分化情况，从而验证该多孔聚合微球作为三维支架供细胞体外培养的可行性；最后，将粘附BMSCs的多孔聚合微球用于SD大鼠横突间融合模型，观察并检测横突间新骨生成情况，并判断其作为骨移植的生物替代材料用于脊柱融合治疗的可行性；并通过Micro CT及免疫组化等方法探索其作用机制。

外伤引起的骨缺损越来越多且严重，各种骨疾患的治疗需要植骨或骨替代物治疗。特别是近年纳米级微球控释技术的发展和人工可降解材料及其复合材料的不断涌现，为组织工程化人工骨的研发提供了前所未有的机遇和条件。.取大鼠长骨腔骨髓血，结合梯度离心法和差速贴壁法分离纯化出BMSCs，并进行生物学鉴定。所分离培养的细胞的生长特点和表面标志均显示其具有典型的干细胞特征。成脂诱导后可以向脂肪细胞分化。成骨诱导培养后碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，Osteopontin可被明显地检测到，流式细胞术检测成骨细胞表型和胎盘间充质干细胞一致。采用结合复乳溶剂挥干法和发泡法制备工艺获得的rhBMP-2多孔微球缓释载体，平均粒径为510nm，包封率60%；具有初始突释（l d），恒速释药（2~16 d），第三相突释（16~22 d）和渐弱释药（23~30 d）四相典型释药特征，30天总释放为94%左右的药量。BMSCs能较好的吸附和种植到支架表面和孔穴中，经过七天的培养分化增殖，贴壁细胞不但可以继续牢固的在微球支架表面生长附着，而且通过微球支架的表面孔径进入微球内表层的细胞也可以进一步生长。在一定限度内，rhBMP-2对BMSCs增殖、分化以及成骨效应存在剂量-效应关系。多孔微球最大理论释放rhBMP-2浓度为200ng/ml与400ng/ml时刺激BMSCs细胞增殖效应最强；碱性磷酸酶活力随给予浓度的增高而增强；最大理论释放浓度为100ng/ml和200ng/ml时骨钙素分泌量最大。PLGA纳米级rhBMP-2缓释载体组显著强于rhBMP-2单纯给予组。微球承载3μg的rhBMP-2或者联合复合BMSCs的多孔微球支架用于单侧的大鼠后外侧横突间融合模型，获得了100%的融合率。单用rhBMP-2组获得了33.3%的融合率，而微球支架复合BMSCs组未获融合。4周时 PLGA材料体内代谢充分。.梯度离心法和差速贴壁法能够分离纯化BMSCs，值得推广。结合复乳化溶剂挥干和发泡法制备工艺制备PLGA多孔微球rhBMP-2缓释载体，是临床治疗的新方法和新思路。PLGA微球可为BMSCs的粘附、增殖提供适宜的生长微环境。PLGA多孔微球能够稳定持续释放rhBMP-2，促进体外BMSCs增殖、分化及成骨，为骨组织工程中骨生成因子的局部控释提供了一个新的解决途径。