新生大鼠的耳蜗发育与三磷酸腺苷（ATP）的关系

在耳蜗发育过程中，暂态结构K?lliker器的支持细胞自发释放ATP，作用于邻近内毛细胞的嘌呤受体，模拟声输入的效应，以此促进内毛细胞功能的成熟。但耳蜗发育与ATP的关系尚存在许多空白。在前一项国家自然基金项目中，我们首次研究了不同鼠龄大鼠耳蜗中柯替氏器、K?lliker器和螺旋神经节细胞的突触素、分泌粒蛋白II和VAMP2表达差异，其在耳蜗中的分布与神经生物活动存在紧密联系。并首次研究了血管纹缘细胞释放ATP的机制。本项目拟通过流式细胞术、ATP检测、蛋白印迹、原位杂交、免疫组织化学、激光共聚焦显微镜研究出生后1-12天这一发育的关键阶段大鼠的K?lliker器支持细胞凋亡及其机制、ATP释放机制，耳蜗缝隙连接蛋白Cx26和Cx30、嘌呤受体的表达和分布，以及耳蜗支持细胞之间、支持细胞与毛细胞之间的细胞内钙信号传播，期望揭示耳蜗发育与ATP的关系，对阐明外周听觉系统的发育机制有重要意义。

在耳蜗发育过程中，暂态结构Kölliker器支持细胞（KOSC）自发释放ATP，作用于邻近内毛细胞的嘌呤受体，模拟声输入的效应，以此促进内毛细胞功能的成熟。但耳蜗发育与ATP的关系尚存在许多空白。本项目的主要研究内容包括KOSC凋亡及其机制、ATP释放机制，耳蜗发育过程中缝隙连接蛋白Cx43、细胞钙库钙释放通道-IP3受体的表达、Pannexin1表达与分布特点、嘌呤受体P2X7的表达和分布，以及耳蜗血管纹缘细胞内ATP囊泡性质的研究。主要结果及简要意义如下。在出生之后、听力出现之前，大鼠耳蜗发育的整个阶段，Kölliker器自底回向顶回发生退化，且表现为时间依赖性。caspase-3、caspase-8、caspase-9及bcl-2的mRNA和蛋白的表达水平均呈明显的时间规律性。大鼠KOSC在体外无明显凋亡，呈线性增长趋势。高浓度的Ca2+可能是引起在体KOSC逐渐凋亡的因素，而高浓度的K+及谷氨酸对在体KOSC有一定的保护作用。体外培养的新生大鼠耳蜗KOSC内存在并释放ATP。细胞内、外液中Ca2+浓度的变化可能通过调节半通道的开放而影响KOSC释放ATP。在听觉出现前，Cx43特异性表达在内、外毛细胞下面的传入神经末梢内螺旋丛与外螺旋束，并伴随耳蜗传入神经发育成熟的过程，表明Cx43构成的缝隙连接在耳蜗传入神经发育及听觉神经传递中发挥十分重要的作用。不同鼠龄大鼠耳蜗螺旋神经元胞浆中均有Cx43表达，我们推测耳蜗螺旋神经元可能是Cx43致聋的靶细胞。IP3受体在耳蜗Corti器毛细胞和支持细胞的表达存在随鼠龄的增加呈现时空差异性表达的特点，这表明IP3受体参与耳蜗发育及耳蜗功能的调控，如神经递质释放、声音转导等。Pannexin1通道蛋白在小鼠耳蜗呈时空差异性表达模式，表明其参与耳蜗发育及听觉形成；Pannexin1通道蛋白染色呈“线型”均匀分布在3个Deiters细胞一侧的细胞膜，与传统意义上的缝隙连接蛋白染色明显不同，提示Pannexin1通道蛋白可能通过形成单个膜通道在耳蜗细胞发挥重要的作用。P2X7表达在Corti器感觉毛细胞的表皮板，这表明P2X7可能是继P2X2之后，作为一种候选P2X离子型嘌呤受体，介导ATP诱发的钙反应，从而在耳蜗生理功能发挥重要的作用。首次发现血管纹缘细胞中的ATP囊泡是溶酶体结构，可通过钙离子依赖的溶酶体胞吐作用释放ATP。