向日葵长花瓣突变系的相关基因克隆及功能研究

长花瓣向日葵突变系外形酷似菊花，极具观赏性，能稳定遗传。其主要为两性花花瓣延长，雄蕊略小；小花的其它结构的无明显变化。根据文献报道，在拟南芥和百合中克隆到与花瓣长度相关的功能基因，其主要作用是使花瓣缩短，且花柄、萼片或雄蕊同时缩短。比较发现，我们培育的向日葵的长花瓣突变系具有不同的特征，表明该突变性状的形成具有不同的分子机制。本项目拟以突变系为研究对象，以短花瓣向日葵作对照进行如下研究：1）通过组织学切片观察长花瓣的发育过程；2）抑制差减杂交筛选与长花瓣性状形成的相关基因的cds序列, RACE法克隆结构基因序列，进行序列测定和生物信息学分析；3）Real-time PCR和RNA原位杂交分析基因时空表达，目的是克隆长花瓣形成的相关基因，探讨基因的功能。所获得的结果将为最终揭示长花瓣产生的分子机制奠定基础，也可为花卉定向改造，提高花卉的观赏性创造条件。

本项目以长花瓣突变系五种类型（Ⅰ到Ⅴ）和野生型（Ⅵ）向日葵为实验材料,进行组织学和解剖学研究。柱头长度、花丝长度、花药长度与花瓣长度的相关性分析表明，花瓣长度与花药长度之间存在显著的负相关性；雌蕊柱头的长度、花丝的长度与舌状化花瓣的长度无相关性。花粉活力和和柱头可授性分析显示，长花瓣性状只影响到花药发育和花粉数量,不影响花粉活性。长花性状与柱头可授性和自然结实率呈负相关。组织学观察和统计分析发现，花瓣延长是通过细胞数目增多和促进细胞膨大共同造成的，而其中细胞数目增多是引起花瓣延长的主要因素。.大田杂交实验结果显示由两个以上突变基因控制的性状。以正常向日葵花序为driver，以长花瓣突变系为tester，成功构建差减杂交（SSH）文库。从正向文库中筛选399个克隆进行测序，得到大于100bp的UniESTs的309条高质量cDNA，占测序总数的77.44%，其中有20个contigs，289个singlets；将309条ESTs序列进行BLASTx比较结果显示，154条序列与已知基因具有较高的同源性，占全部ESTs序列的48.83%。同源性较高基因绝大部分来源于拟南芥、棉花、向日葵、蓖麻、葡萄、杨树等植物。筛选到基因包括氨基酸代谢、非生物胁迫、细胞生长与分裂、光合作用、植物胚胎发育、种子发育、花序发育等。.对Ⅰ型和Ⅵ型开花前0-10d（Stage3）,10-20d（Stage2）及20-30d（Stage1）样本进行转录组分析。总共获得了59700个ungenes，其中Stage1期间突变体和野生型之间差异基因为7750个，Stage2期间为14036个，Stage3期间为18463个。转录组差异基因韦恩图分析结果显示Stage1和Stage2两个时期共有差异基因为3309个，Stage2和Stage3共有差异基因为5203个，Stage1和Stage3两个时期共有差异基因为2830个；且三个时期共有差异基因为1382个。差异基因做GO分析结果显示，三个时期的差异基因在生物学进程中均主要富集在DNA复制、修复和姐妹染色单体凝聚等生物学进程中，在细胞成分均主要富集在DNA聚合酶复合体、细胞壁成分组成以及胞间连丝构建上，在分子功能方面主要富集在DNA聚合酶活性作用，特异性DNA结合转录因子活性，双链DNA结合，弯曲DNA富集和单链DNA3'-5'脱氧核糖核酸外切酶活性