大豆固氮根瘤中microRNA表达和功能分析

大豆根瘤固氮是非常重要的农艺性状，大豆和根瘤菌共生固氮性状形成的分子机制也是一个很重要的生物学问题。最新的结果证明了miRNAs参与了大豆和根瘤菌相互作用，我们的前期研究结果在国际上首次报道了miRNA参与根瘤固氮过程，并鉴别出了3个固氮根瘤中特有的miRNAs。为了进一步研究是否特定的miRNA参与调控根瘤固氮生物过程，我们将：1）通过芯片技术进行miRNA表达谱的分析，找出固氮根瘤中特异表达的miRNAs; 2) 找出根瘤中这些特定miRNA的靶基因，分析这些基因在根瘤形成不同阶段和固氮过程中表达规律；3）研究影响固氮效率的重要非生物因子（干旱、盐胁迫、冷害和低氮/磷）对根瘤特异miRNAs表达的影响以及靶基因的表达变化；4）研究敲出特异miRNA对根瘤固氮效率的影响。该研究将有助于我们了解大豆固氮过程调控的分子机制，对未来提高大豆固氮效率的品种改良有重要的应用价值。

大豆是重要经济作物。根瘤菌和大豆共生关系建立和固氮效率对大豆的产量和品质起着决定性作用，在盐胁迫下共生固氮受到影响更大。但我们对大豆根系结瘤和固氮效率调控分子机制了解甚少。miRNA作为一类21-24nt的非编码小RNA，在动植物发育和逆境响应过程中具有重要作用。为了全面揭示大豆成熟根瘤及盐胁迫下miRNA介导的固氮效率调控的分子机制，本项目用根瘤菌侵染后28天（固氮根瘤）有无盐胁迫处理（6小时）为材料，采用高通量测序技术，在全基因组水平了解了固氮根瘤对盐胁迫和低温响应的miRNA表达变化模式，并发现多个miRNA参与根瘤和固氮对逆境的适应。共鉴定到12个在大豆功能根瘤中表达水平明显高于其他组织的miRNAs，可能反应根瘤的独特表达模式。也对其靶基因做了预测和部分的验证和表达分析。. 对miRNA和靶基因的表达和功能验证发现三个miRNA通过靶基因在调控大豆根系结瘤和固氮效率中起着关键调控作用。miRNA gma-miR-NSR1（Nodule Specific miRNA 1）在固氮根瘤中尤其在成熟根瘤的类菌体区的表达很高。过表达miR-NSR1可使大豆转化根的根瘤数目比未转化的根瘤数增加65%。利用生物信息学预测和5‘RACE方法验证，找到1个GmGAL1（Gm AP2 Like）基因是miR-NSR1的靶基因。敲除GmGAL1也使转化大豆根瘤数目增加约70%。证明gma-miR-NSR1直接通过剪切GAL1的mRNA来介导大豆根系结瘤过程。发现过表达gma-miR-NSR1或者GmGAL1 RNAi转化根的根瘤固氮酶活均较对照分别增加了70%和63.2%。说明gma-miR-NSR1及其靶基因GmGAL1作为一个重要分子模块不仅调控大豆根系结瘤，还决定根瘤的共生固氮效率高低。此外，还发现gma-miR-EN通过生长素相关靶基因调控大豆根系结瘤过程；发现gma-miR4416b调控大豆根和根瘤对盐胁迫的响应。. miRNA在根瘤发育中的功能研究仅有一个报道，而固氮效率调控中起关键作用的miRNA在国际上还未见到报告。我们的结果首次发现了一个在大豆固氮效率调控中的重要调控分子模块。这项突破性成果，将为解析大豆根瘤固氮效率分子机制开辟新的思路，也为转基因手段和分子辅助育种培育固氮效率高的新品种提供基因资源和科学依据。