基于ATP等辅因子调控的环磷酸腺苷异源合成途径构建

ATP and other cofactors play a significant role in physiological and metabolic processes. Manipulation of cofactors could be a powerful tool for the specific goal of industrial technology in order to substantially improve biosynthesis efficiency. The complete genome of Arthrobacter sp.CGMCC 3584 was sequenced in our previous work. Based on this, the functional module for cAMP biosynthesis can be analysed for the gene level. We expect to assemble parts, including promoter, ribosome bind site, open reading frame, terminator and so on, for the needs of engineering target. The biochemical pathway can be assembled in a single step via in vivo homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae, and achieved heterologous expression in different chassis. The optimization of promoter and plasmid is conducted for fitness of heterologous functional modules and chassis. Furthermore, the relationship between cofactors supply and metabolic pathway is analysed and the appropriate strategy of cofactor manipulation is determined. The function of artificial cell is optimized by reasonable redistribution of metabolic flux, to achieve the goal products effectively. The study methods for the construction of cAMP biosynthetic pathway based on ATP and other cofactors manipulation could offer a reference to the production of other bio-based chemicals. So this project shows great study signifinace and potential application.

能量ATP等辅因子在生理过程和代谢过程中具有重要作用，辅因子的调控可以为实现特定的工业技术目标提供一个强大的工具来大幅度提高生物合成的效率。实验室前期进行了高产环磷酸腺苷节杆菌的全基因组测序，在此基础上从基因层面剖析cAMP生物合成的功能模块，将基因元件（启动子、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等）有机重构，运用酵母体内同源重组技术完成多片段DNA的高效拼接，实现功能模块在不同底盘宿主中的异源表达，通过启动子和载体优化等方法完成外源功能模块与底盘细胞的适配；结合辅因子供应与代谢途径间关系的分析确定合适的辅因子策略，实现人工细胞中代谢流的合理重分配，从而优化底盘细胞的功能，最有效地合成目标产物。本项目提出的基于ATP等辅因子调控完成cAMP的生物合成途径的构建及异源表达的研究方法，可为其他生物基化学品的生产提供借鉴意义，本项目的研究具有重要的科学意义和应用潜力。

能量ATP等辅因子在生理过程和代谢过程中具有重要作用。实验室前期进行了高产环磷酸腺苷节杆菌的全基因组测序，在此基础上将cAMP生物合成的嘌呤补救合成途径的功能基因进行了克隆表达。通过不同来源的基因（包括腺苷激酶AK、乙酸激酶ACK和腺苷酸激酶ADK等）在不同底盘宿主（包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌）中表达效果比较，结果表明大肠杆菌为最佳的宿主。构建了多酶共表达重组大肠杆菌(E. coli BL21(DE3)/pET28a-AK-ACK-ADK和E. coli BL21(DE3)/pET28a-AK-AC-ACK-ADK)，构建了基于腺苷的cAMP生物合成途径。此外，过程分析表明盐的积累会抑制合成cAMP过程中关键酶ACK的活性，ACK可能是该过程的限速步骤。通过对天然耐盐酶的耐受机制进行了初探，借鉴了天然嗜盐酶的一种耐盐机制，增加蛋白质表面酸性残基数量。以计算机辅助理性设计了一种新型耐盐ACK，突变体在高盐环境中的依然拥有较高的催化活性。本项目涉及的cAMP的生物合成途径的构建方法，以及理性设计改造耐盐型酶的方法，可为其他生物基化学品的生产提供借鉴意义。