外泌体传递的长链非编码RNA lncLCSC对HBV相关肝癌干细胞的调控作用及机制研究

The incidence and mortality of liver cancer is high. Hepatitis B virus (HBV), which is one of the main causes of hepatocellular carcinoma (HCC), is closely associated with the occurrence and development of HCC. Therefore, it is crucial to elucidate the HBV-related molecular mechanism for improving the prognosis of patients with HCC. Our previous studies (Youth Project) have shown that HBx encoded by HBV can regulate the properties of liver cancer stem cells (LCSCs). Recently, we found that the long chain non-coding RNA (lncLCSC), which was screened out from exosomes of HBV-related LCSCs, regulated the stem-like properties of LCSCs through Wnt/β-catenin. Therefore, on the basis of our previous studies, this project will continue to: 1) examine the regulation of lncLCSC on the characteristics of LCSCs via molecular biology experiments, and so on; 2) elucidate the molecular mechanism underlying HBx regulating loading and secretion of the exosomes-transmitted lncLCSC by Western blot, ChIP and so on, and examine the molecular mechanism of exosomes-transmitted lncLCSC mediating the characteristics of LCSCs through Wnt/β-catenin; 3) discuss the clinical significance of exosomes-transmitted lncLCSC in the postoperative recurrence monitoring, prognosis and chemo-resistance evaluating of patients with HBV-related HCC by examining HBV-related HCC samples and patient-derived xenograft (PDX) model.

肝癌的发病率及病死率较高，乙肝病毒（HBV）是肝癌的主要病因之一，与肝癌的发生及发展密切相关，因此阐明HBV相关分子机制对改善肝癌患者的预后至关重要。前期研究（青年项目）表明HBV编码的HBx可调控肝癌干细胞特性，我们近期通过表达谱芯片筛选出HBV相关肝癌干细胞来源外泌体中的长链非编码RNA（lncLCSC），并证明lncLCSC可通过Wnt/β-catenin调控肝癌干细胞特性，因此本项目在前期基础上进行延续性研究：1）通过分子生物学等实验阐明lncLCSC对肝癌干细胞特性的调控作用；2）利用蛋白质印迹、ChIP等明确HBx调控外泌体lncLCSC装载和分泌的机制，并阐明外泌体lncLCSC通过Wnt/β-catenin调控肝癌干细胞的分子机制；3）通过HBV相关肝癌样本、人源化肿瘤移植模型（PDX）探讨外泌体lncLCSC在HBV相关肝癌患者术后复发监测、预后及耐药评估等中的临床意义。

乙型肝炎病毒（HBV）是肝癌的重要发病原因之一，并与肝癌的发生、发展以及肝癌患者的预后密切相关，因此阐明HBV相关分子机制对改善肝癌患者的预后至关重要。我们的前期成果表明HBV编码的HBx蛋白可通过调控OV6阳性肝癌干细胞促进肝癌的进展和转移，但具体分子机制还有待进一步阐明。因此，本项目在前期的基础上，筛选出HBV相关lncRNA——lncLCSC，阐明了lncLCSC对OV6阳性肝癌干细胞特性的调控作用及分子机制，并阐明了相关标志物在评估肝癌患者预后中的临床意义：1）首先筛选并验证了OV6阳性肝癌干细胞中表达较高的HBV相关lncRNA——lncLCSC；2）通过定量PCR检测、成球实验以及NOD/SCID小鼠成瘤实验证明了过表达lncLCSC可促进OV6阳性肝癌干细胞的干细胞相关基因表达升高、自我更新能力及成瘤性增强，而敲低lncLCSC则抑制OV6阳性肝癌干细胞的干细胞相关基因表达、自我更新能力及成瘤性；3）通过共培养实验、定量PCR及迁移实验检测发现，OV6阳性肝癌干细胞可促进单核/巨噬细胞的趋化，下调单核/巨噬细胞M1基因的表达并上调M2基因的表达，而在OV6阳性肝癌干细胞中过表达lncLCSC，则可进一步促进上述效应，相反敲低lncLCSC则削弱上述效应；4）通过共培养实验、定量PCR及成球实验检测发现，活化的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可上调OV6阳性肝癌细胞的干细胞相关基因的表达和自我更新，而在OV6阳性肝癌干细胞中过表达lncLCSC可进一步促进上述效应，相反在OV6阳性肝癌干细胞中敲低lncLCSC则可削弱上述效应；5）通过免疫组织化学及统计学分析发现，肝癌组织中OV6的表达水平与TAMs标志物CD68呈正相关，OV6与CD68表达都高的肝癌患者的预后最差，而OV6与CD68表达都低的肝癌患者预后最好；通过一致性指数（C-index）分析发现，将OV6与CD68联合起来预测肝癌患者预后的效能高于单独指标如肿瘤大小、微血管转移、OV6或者CD68，而将OV6、CD68和肿瘤大小及微血管转移联合起来，预测肝癌患者的预后效能最高。本项目不仅为HBV相关肝癌干细胞的调控机制提供了新的理论依据，还为HBV相关肝癌患者的预后评估提供了新的指标。