生长素调控植物细胞网格蛋白质膜招募的分子机理研究

Clalthrin-mediated endocytosis (CME), a major mode for plasma membrane protein endocytosis in eukaryotic cells, is directly involved in regulation of many important cellular processes, including uptake of extracellular nutrients, abundance of important PM proteins, and transduction of intra- and extracellular signals. Our previous studies have shown that plant hormone auxin rapidly and effectively inhibits clathrin light chain (CLC) recruitment to the PM and endocytosis of auxin efflux transporter PIN proteins and thereby promotes auxin efflux transport, which is one of critical mechanisms for auxin regulation of organogenesis and development in plants. However, the molecular mechanisms in which auxin modulates PM recruitment of CLCs are poorly understood so far. This proposal will use a site-directed mutagenesis, combined with modern live-cell imaging methods, to identify functional roles for CLC candidate phosphorylation sites in auxin regulation of clathrin recruitment to the PM. This study will primarily elucidate the details for auxin-regulated clathrin PM recruitment and thereby PM endocytosis and provides new insights into the mechanisms and regulatory roles of polar auxin transport during plant developmental and tropic growth.

网格蛋白介导的内吞是真核细胞质膜蛋白内吞的最主要方式之一，直接调控胞外营养物质吸收、重要质膜蛋白丰度和胞内外信号传递等重要细胞生物学过程。项目前期研究结果表明，植物内源激素生长素能快速抑制网格蛋白轻链质膜招募和生长素极性输出载体PIN蛋白内吞，从而促进生长素自身的极性输出，是生长素调控植物器官发生与发育的重要机制之一。然而，生长素是如何调控网格蛋白轻链质膜招募的分子机理至今仍不清楚。本申请项目运用定点突变技术，结合现代活细胞成像分析技术，分析鉴定拟南芥网格蛋白轻链候选磷酸化位点在生长素调控网格蛋白质膜招募中的生物学功能，初步阐明生长素调控网格蛋白质膜招募和质膜内吞的分子机理，为解析生长素极性运输机制及其在植物生长发育和向性生长中的调控功能提供新的观点与见解。

网格蛋白介导的内吞CME (clathrin-mediated endocytosis)是质膜内吞的主要途径之一，在胞外营养物质吸收、质膜蛋白和脂质丰度及其胞内外信号传递等重要细胞生命活动过程中具有重要调控作用。在植物细胞中，虽然生长素能快速抑制网格蛋白轻链质膜招募来限制生长素极性输出载体PIN的内吞，从而促进生长素的自身输出的调控过程已较为清楚，但生长素是如何调控网格蛋白轻链质膜招募的分子机理至今仍不清楚。本项目拟剖析生长素调控网格蛋白轻链质膜招募的分子作用机理，进而更好的了解网格蛋白介导的内吞的生物学功能和分子机制。目前已获得了以下主要研究结果：(1)利用蛋白磷酸化位点预测软件筛选到14个CLC1候选磷酸化位点，并完成了14个候选位点的突变、表达载体构建和转基因工作。利用激光共聚焦显微镜活细胞成像技术分析结果显示，分别突变X或X2位点导致生长素对网格蛋白轻链质膜招募的影响被削弱，当同时突变X和X2位点使得网格蛋白轻链质膜招募对生长素更加不敏感。为进一步剖析CLC蛋白磷酸化介导生长素调控CLC招募提供了遗传学和细胞学证据；(2)磷酸化分析发现X和X2位点突变导致CLC磷酸化水平降低。光漂白实验进一步验证了X和X2位点在CLC质膜招募中的重要作用；(3)前期研究表明CLC1基因敲除会造成花粉不育，而CLCX/X2-GFP/clc1（clc1纯合）材料中，背景clc1纯合的比例约为4.9%，说明候选磷酸化位点X和X2在CLC1缺失造成的花粉致死中具有重要的功能。(4)初步阐明了X和X2磷酸化位点对网格蛋白介导的内吞的影响。活细胞成像分析表明，X和X2磷酸化位点的破坏能抑制质膜蛋白PIN2的内吞，内吞示踪染料FM4-64的吸收和生长素的分布；(5)另外还解析了网格蛋白轻链通过调控下胚轴PIN3的侧定位，从而介导生长素从下胚轴中柱分配到表皮细胞促进下胚轴伸长；(6)分析了AP-1介导的后高尔基转运通过调节绒毡层细胞和小孢子中蛋白质的转运在花粉壁发育中发挥重要作用。.受本项目资助下，已发表相关学术论文SCI刊物1篇，另有1篇New Phytologist稿件已修回。培养研究生7人，正在培养4人。