AMPK通过Trx系统调控MG53参与骨骼肌细胞膜修复的机制研究

Myopathy is a common complication of severe burn patients. The main cause of skeletal myopathy after burn injury is failure to repair injured membrane. Inhibition of AMPK is one of reasons leading to the myopathy after burn injury, but if it disturbs sarcolemmal repair is unknown. Recently, we demonstrated that inhibiting AMPK can disturb the structure of membrane repair protein MG53, and induce sarcolemmal repair defect. AMPK plays key role in reduction of protein disulfide via Trx system, may be crucial for maintaining MG53 structure. Therefore, we suppose that AMPK may regulate MG53 via Trx system and participate in sarcolemmal repair response. To test this hypothesis, we will first detect muscle membrane repair capacity after inhibition of AMPK using RNAi and inhibitors.Then, we analysis the effect of AMPK and Trx on MG53 structure and function using three-dimensional electron microscopy. This study is expected to explain the mechanisms of AMPK regulating sarcolemmal repair.

骨骼肌病是烧伤患者的常见并发症，肌细胞膜损伤后修复障碍是引起骨骼肌病的重要因素。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性降低是导致烧伤后骨骼肌病的重要原因，但其是否与烧伤后肌细胞膜修复障碍相关，还不清楚。前期工作发现，抑制AMPK将引起膜修复蛋白MG53结构异常，肌细胞膜修复能力显著下降。AMPK可通过硫氧还蛋白(Trx)系统还原蛋白质二硫键，使蛋白恢复原有结构及生物学活性，其可能在调节MG53中发挥关键作用。据此提出AMPK可能通过调控Trx系统，影响MG53的结构与功能，从而参与肌细胞膜修复反应的假说。为此，本项目拟采用特异性抑制剂和RNA干扰技术抑制AMPK和Trx活性，检测其对骨骼肌细胞膜修复的影响，并采用三维电镜观察抑制AMPK和Trx后MG53结构及功能的变化。本研究有望初步阐明AMPK参与肌细胞膜修复的分子机制。

以往对AMPK功能的认识主要集中在调控肌细胞能量代谢上，本课题从骨骼肌肌细胞修复的角度，探索AMPK影响骨骼肌代谢的其他分子机制。本课题通过三年的研究，着重观察了AMPK、Trx和PDIA3对骨骼肌细胞损伤后修复的影响，证实了AMPK、Trx和PDIA3是调控骨骼肌细胞修复的重要蛋白分子，并基本阐明了AMPK、Trx和PDIA3调控骨骼肌细胞修复功能的具体分子机制。本研究首先采用毒素、电穿孔、激光打孔等方式诱导肌细胞损伤，并通过免疫印迹、免疫荧光和免疫组化等方法检测肌细胞损伤后AMPK、p-AMPK、Trxip、Trx和PDIA3等蛋白的表达。利用活性抑制剂或基因敲除，干扰AMPK、Trx或PDIA3蛋白功能，进而评估AMPK、Trx和PDIA3对肌细胞损伤后修复的影响。最后，敲除AMPK基因，并观察肌细胞AMPK, p-AMPK、Trxip、Trx和MG53多聚体等蛋白表达变化，对AMPK调控肌细胞膜修复的分子机制进行深入探索。我们的研究发现，骨骼肌肌细胞损伤后，p-AMPK、Trxip和PDIA3表达明显增加，Trx表达明显降低，抑制AMPK、Trx或PDIA3活性或敲除AMPK、Trx或PDIA3基因可导致肌细胞修复障碍，加重肌细胞损伤。AICAR激活AMPK，使Trxip表达降低，增加肌细胞Trx表达，敲除AMPK基因将促进Trxip表达，继而抑制肌细胞Trx表达。本研究证实了AMPK、Trx和PDIA3在骨骼肌肌细胞膜修复中发挥重要作用，并明确AMPK通过Trxip/Trx调控MG53多聚化，继而参与调控肌细胞损伤后修复，这为通过调控AMPK、Trx和PDIA3治疗相关骨骼肌病提供理论依据。