白桦MYB转录因子调控次生细胞壁形成的功能研究

MYB transcription factors are involved in development and metabolism processes of plants,and play important roles in secondary cell wall synthesis of palnts. Based on the fundation of cloning a BpMYB2 gene that is found to related to secondary cell wall development from Betula Platyphylla. The transgenic plants overexpressing or inhibit expressing BpMYB2 gene will be generated in this project, and the differences of cell wall shapes and chemical contents between the transgenic plants and control plants are analyzed.The transcriptoms of the transgenic plants and control plants are bulit using the high throughput sequencing method. Then the down-stream target genes of BpMYB2 will be determined by comparinsing the differentially expressed genes between overexpression and inhibit expression transgenic palnts. The promoters of the target genes are cloned base on the genomic information of B.platyphylla available now. Moreover, some target genes will be selected for confirmation by ChIP (chromatin immunoprecipitation assay) method. The motifs of the target gene promoters are searched using MEME sofeware, and the conserved seuquences among these promoter will be identified. The conserved seuquences identified by MEME may bind to the MYB, and the specific binding between BpMYB2 and the conserved seuquences will be verified using EMSA (electrophoretic mobility shift assay ). These results may be contributed in revealing the molecular mechnism of secondary cell wall synthesis regulated by MYB, and provide the base for molecular breeding of trees.

MYB转录因子家族成员参与植物发育和代谢等多种生理过程，在调节次生细胞壁发育中具有重要的作用。本研究在获得了白桦次生细胞壁发育相关MYB转录因子BpMYB2基础上，分别在白桦中过表达和抑制表达BpMYB2，分析转基因和野生型植株之间次生细胞壁形态，纤维素、半纤维素和木质素量等性状的差异，确定BpMYB2对白桦次生细胞壁形成的影响；通过转录组学分别比较转基因和野生型植株间的基因表达差异，筛选BpMYB2所调控的下游靶基因，在白桦基因组信息的基础上克隆重要下游靶基因启动子，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术进一步验证。利用MEME软件分析BpMYB2所调控的下游靶基因启动子的保守序列，进而筛选出BpMYB2识别的顺式元件，并利用EMSA等技术进一步验证。通过对BpMYB2所调控的下游靶基因及识别元件分析阐明其调控次生细胞壁发育的分子途径。为利用分子生物学手段培育优良白桦材新品种奠定基础。

本研究分别在白桦中过表达和抑制表达BplMYB46，确定其对白桦次生细胞壁形成的影响；通过转录组学筛选BplMYB46所调控的下游靶基因；分析BplMYB46识别的顺式元件；通过对BplMYB46所调控的下游靶基因及识别元件分析阐明其调控次生细胞壁发育的分子途径。获得以下主要结果：BplMYB46基因过表达白桦株系苗期的次生木质部发育程度较高，抑制表达的次生木质部发育程度较低；过表达白桦株系的木质素和半纤维素含量比野生型高，纤维素含量比野生型低；抑制表达株系相反。对BplMYB46基因过表达和抑制表达转基因白桦进行数字基因表达谱测序分析，结果发现2421条差异表达的基因，其中上调表达的基因为952条，下调表达的基因为1469条；差异基因涉及新陈代谢、次生代谢、植物激素信号转导途径以及苯丙烷和类黄酮生物合成等途径。在差异基因中发现与木质素和纤维素合成相关基因，证明BplMYB46能够调控次生壁合成相关基因的表达。进一步分析显示，与木质素、纤维素合成相关的酶PAL、CCo、4CL、POD、LAC、CESA和3个可能与次生壁合成相关的MYB转录因子在BplMYB46过表达白桦中上调表达，在抑制表达白桦中下调表达，说明BplMYB46基因能够通过调控木质素、纤维素合成相关基因的表达来促进白桦次生壁的形成；利用酵母单杂交技术确定BplMYB46基因能识别8个顺式作用元件，分别为E-box、LTRECORE、GT-1、M1、M2、M3、TCbox和AGbox，其中E-box元件主要参与光响应和苯丙氨酸生物合成途径，M2是拟南芥AtMYB46识别的与次生细胞壁形成相关的元件，TC-box和AG-box为两个未知功能的元件，可能是BplMYB46转录因子结合的新元件。酵母单杂交及ChIP-PCR技术分析发现BplMYB46能够与靶基因启动子序列上的顺式作用元件结合，从而直接调控这些与次生细胞壁形成相关的靶基因的表达。本研究通过对BpMYB46所调控的下游靶基因及识别元件分析阐明其调控次生细胞壁发育的分子途径，为利用分子生物学手段培育优良白桦材新品种奠定基础。