基于代谢酶/转运体的中药蟾酥代谢规律与体内作用物质基础的研究

Chansu, a traditional Chinese medicine, showed the significant anti-cancer bioactivity. And its major chemical constituents bufadienolides were more bioactive than some anticancer agents in clinic, with the IC50 values at the level of nM against the various cancer cells. However, bufadienolides also exhibited the side effect of myocardium. In the previous study, the investigations about chemical constituents, biotransformation and metabolic properties of Chansu have been conducted. So we tend to use the metabolic fingerprint and serum pharmacochemistry methods to identify the original compounds and metabolites in vivo, according to our previous research. Then, the metabolic properties of these prime compounds of Chansu including metabolites identification, assignment of metabolic enzymes and transporters, kinetic parameters and species difference studies, should be characterized. And we could elucidate the vital relationships between chemical structures and major metabolic enzymes and transporter, by using the chemometrics approaches. And then, the biological activities and toxicity of these target compounds should be evaluated by the classical methods of pharmacology. On the basis of above research, we hope to find some bufadienolides with the high effect, low toxicity and better metabolic properties, for development of novle anti-cancer agents and elucidation of the real bioactive substance basis of Chansu in vivo.

中药蟾酥临床上表现出极强的抗肿瘤作用，其主要成分蟾毒甾烯类化合物对各种恶性肿瘤细胞的IC50值均为nM级，强于临床上的一线抗肿瘤药物，但也表现出一定的心肌毒副作用。本课题组前期已经完成了蟾酥的化学成分及部分成分的生物转化、代谢属性研究。结合前期工作基础，申请者拟采用代谢指纹图谱和血清药物化学手段，指认出蟾酥体内移行的原型成分和代谢产物。在此基础上对体内主要移行的原型成分进行基于代谢酶和转运体的代谢属性表征，包括代谢产物快速分离鉴定、代谢酶和转运体的归属、代谢动力学参数测定以及基于代谢酶的种属差异研究等。利用化学计量学手段，总结蟾毒甾烯类成分化学结构与主要代谢靶点（代谢酶和转运体）之间的关系。并利用经典的药理学手段评价体内移行的原型成分和代谢产物的药理活性与毒性。综合上述信息，阐明蟾酥于体内的真正作用物质基础（代谢属性好、高效低毒的蟾毒甾烯类成分），同时为将其开发成为新型抗肿瘤药物奠定基础。

本项目通过多种途径制备了蟾毒甾烯类成分的代谢产物，用于代谢属性研究。通过重组单酶、肝微粒体等，系统研究了蟾酥中主要的蟾毒甾烯类成分的体外代谢属性，发现了CYPs介导的Ι相代谢反应，SULTs及UGTs介导的磺酸化、葡萄糖醛酸化代谢反应。综合分析了蟾毒甾烯类成分结构与代谢属性之间的构效关系。同时，发现了多个具有较高选择性的蟾毒甾烯类化合物，可用于相关代谢酶的探针底物。本项目还对蟾毒甾烯类成分的相关代谢产物进行了细胞毒性评价，证明了相应的代谢途径是蟾酥中主要活性成分的体内解毒途径。蟾毒甾烯类成分的代谢属性的系统表征，为中药蟾酥的合理使用及配伍提供了重要参考。.(1)以大鼠作为代谢平台，完成了代表性蟾毒甾烯类成分蟾毒灵的体内代谢产物制备，且均为CYP代谢酶催化的Ι相代谢产物。细胞毒性评价显示，Ι相代谢产物为蟾毒灵的体内解毒形式之一。.(2)通过真菌A. elegans AS 3.2778介导的微生物转化技术，对脂蟾毒配基进行了转化产物的制备，以模拟制备其相关的代谢产物，最终共分离得到了6个代谢产物。.(3) 系统进行了蟾毒甾烯类成分磺酸化（SULT）代谢属性研究，结果显示均可发生3-OH磺酸化代谢，主要参与的代谢酶为SULT2A1亚型。通过计算机辅助技术，分析了蟾毒甾烯类成分结构与磺酸化代谢的构效关系。同时，发现华蟾毒精可以作为SULT2A1的高选择性探针。.(4)首次对去乙酰基华蟾毒精在不同脏器、不同种属微粒体及单酶亚型进行了体外葡萄糖醛酸化代谢研究。确定了相关的动力学模型、表观动力学参数等，为蟾酥及其主要成分乙酰基华蟾毒精的临床用药提供参考；同时发现乙酰基华蟾毒精可以作为首个同时测定UGT1A3和UGT1A4代谢活性的高选择性探针底物，通过两个不同代谢位点的探针反应来准确测定不同酶源中UGT1A3和UGT1A4的活性。.(5) 日蟾毒它灵在人肝微粒体中主要代谢生成 1α-羟化产物和 5β-羟化产物，CYP3A4为介导该代谢反应的主要代谢酶，符合经典米氏动力学行为。然而CYP3A5催化日蟾毒它灵 1-位羟化反应符合底物抑制动力学行为。