发酵食品中氨基甲酸乙酯形成机制的研究

本项目以不同相态、高氨基甲酸乙酯含量的代表性发酵食品（面包、葡萄酒、酸奶）为对象，利用相关性检验初判、稳定同位素示踪复判的方法寻找氨基甲酸乙酯的前体化合物；在此基础上，简化反应体系，采用稳定同位素示踪和现代检测技术，通过离线与在线相结合的方法监测反应体系成分的变化，明确转化中间体及其生成顺序，阐明前体转化氨基甲酸乙酯的分子路线；然后，采用化学计量学的方法，在简化的反应体系中拟合氨基甲酸乙酯形成的动力学模型，明确影响因素对氨基甲酸乙酯形成的作用，揭示氨基甲酸乙酯产生、积累和消除规律；最后，在发酵食品（面包、葡萄酒、酸奶）中验证动力学模型，研究动力学模型的适用性。本课题旨在从分子的角度阐明发酵食品中氨基甲酸乙酯的形成机制，为改进发酵食品生产工艺，降低其中氨基甲酸乙酯含量奠定基础，同时也为其它有害物质的溯源提供科研思路。

氨基甲酸乙酯是发酵食品中广泛存在的“2A”类致癌物，研究其形成机制进而控制其生成有重要意义。本项目主要研究了葡萄酒中氨基甲酸乙酯的生成机制，所做工作主要包括7各方面：①调研了不同产区、不同品种葡萄汁中的氨基酸含量，在此基础上确定了模拟葡萄汁中的氨基酸组成和含量；②构建了7种氨基酸分别缺失的模拟葡萄汁，比较了这些模拟葡萄汁和全氨基酸的模拟葡萄汁在主发酵后的氨基甲酸乙酯和尿素含量，证明精氨酸对氨基甲酸乙酯的贡献很大；③采用N15同位素示踪证明精氨酸胍基的氮原子参与了氨基甲酸乙酯的合成；④针对尿素和乙醇反应体系，采用Box-Behnken设计研究了温度、pH值和乙醇浓度对氨基甲酸乙酯生成的影响，并根据反应机理，建立了尿素和乙醇亲核取代反应生成氨基甲酸乙酯的表观动力学方程；⑤利用结构类似物的抗性选育出一株精氨酸酶（CAR1编码）酶活相对较低的酵母菌株，用该菌株发酵，氨基甲酸乙酯可以降低60%左右，此内容已申请专利并获授权；⑥利用尿素和EC在一定的条件下都会与9-羟基吨反应生成具有产生荧光特性的基团，建立了一种可以同时检测两种物质的方法，为方便同时监测葡萄酒的尿素和EC提供有效的工具，此内容已发表在农业与食品化学杂志上；⑦利用Real-Time PCR技术研究不同时间段添加缺失的氮源（DAP）对精氨酸和尿素代谢的相关基因表达量的影响，发现在氮源缺乏48 h后添加DAP时，既能够很好缓解发酵停滞，同时也可以控制氨基甲酸乙酯的形成，使葡萄酒酿造过程中产生更少的氨基甲酸乙酯。发表了多篇SCI论文并完成了一部专著“葡萄酒生产技术”，在国内被大量使用。