TALE-DNA支架介导的多酶复合体在威兰胶代谢合成中的定向调控作用与机制研究

Welan gum has great potential to be widely applied in food, petroleum and other industries as a stabilizing, thickening, emulsifying agent because of its excellent rheological properties. Low fermentation yield is a bottleneck restricting its large-scale application. This project will enhance the welan gum production through the spatial organization engineering method of metabolic enzymes. The main research contents are as follows: (1) Artificial DNA scaffolds and transcription activator-like effectors (TALEs) specifically binding with different sequences in DNA scaffolds will be designed and synthesized. Furthermore, the effectiveness of the TALE-DNA scaffold will be verified. (2) Two key enzymes in the biosynthetic pathway of welan gum will be expressed fused with TALEs and their synthetic multi-enzyme complexes will be constructed with the help of specific interaction between TALEs and DNA scaffold. The multi-enzyme complexes will be expressed in the strain Sphingomonas sp. WG to obtain strains with high welan gum productivity. This work will develop spatial organization engineering method of metabolic enzymes based on the substrate channeling, to improve the catalytic efficiency of enzymes at low expression level and realize the enhancement of welan gum production. (3) The transcriptomes and metabolomes of different strains will be analyzed to reveal the mechanism of multi-enzyme complexes to enhance the welan gum production. It will promote the universal application of the spatial organization engineering method of metabolic enzymes and provide the basis for the establishment of a new theory of microbial metabolic engineering.

威兰胶因具有良好的热稳定性、增稠性等性能，可应用于食品、石油等诸多领域。但是，发酵产量较低是制约其大规模应用的瓶颈问题。因此，本项目拟通过建立代谢酶空间组织工程的方法，大幅度提高威兰胶生产水平，推进其工业应用。主要研究内容包括：（1）设计并合成DNA支架和可特异性识别DNA支架上不同靶序列的类转录激活因子效应物TALEs，验证TALE-DNA支架的有效性；（2）将威兰胶合成途径中的关键酶UgpG和WelB分别与TALEs融合表达，借助TALEs与DNA特异性结合形成的支架结构，将关键酶进行组装，构建多酶复合体，模拟底物沟道传递与加工机制，提高酶的催化效率，实现威兰胶产量的大幅提高；（3）利用转录组和代谢组学方法，探索多酶复合体优化细胞代谢路径的分子机制。通过本项目的实施，建立细菌代谢酶空间组织工程方法，并推动该方法在代谢工程中的普遍应用，为建立具有良好普适性的微生物代谢工程新理论奠定基础。

威兰胶（鞘氨醇胶WL）因具有良好的热稳定性、增稠性等性能，可应用于食品、石油等诸多领域。但是，发酵产量较低是制约其大规模应用的瓶颈问题。因此，本项目对威兰胶的合成途径进行了研究，建立了代谢酶空间组织工程的方法，以提高威兰胶产量，推进其工业化应用，主要进行了如下研究：（1）深入研究了威兰胶的合成途径。利用基因敲除、过表达等方式对威兰胶合成途径中多个基因的功能进行了研究，揭示了UDP-葡萄糖前体的合成途径，明确了糖基转移酶WelK的功能，探索了威兰胶合成的调控机制。同时，对合成过程的限速酶进行了分析，推测WelB、AtrB和AtrD是威兰胶合成过程的限速酶，为选择WelB及其级联酶构建多酶复合体，获得高产工程菌提供了理论依据。（2）TALE-DNA支架介导的多酶复合体构建。首先，构建了适用于广宿主的、可灵活实现多基因表达的生物砖载体pBBR1SMCS-BB，在此基础上，利用Golden Gate技术及BioBrick技术的原理，构建了TALE-DNA支架介导的、由WelB、UgpG组成的多酶复合体表达载体，将该载体转化鞘氨醇单胞菌，构建得到了鞘氨醇单胞菌工程菌株。（3）基于LB克隆系统，利用多酶融合表达技术构建多酶复合体。为灵活、定向构建多酶复合体，设计开发了LB克隆系统。以该系统为基础，构建得到了WelB、WelK、WelL、WelQ四种糖基转移酶以不同顺序、不同方向融合表达的多酶复合体，对多酶复合体的组成进行了优化，得到了一株威兰胶高产菌株，其威兰胶产量较野生株提高了约29.7%。此外，还得到一株高粘度菌株，其发酵液粘度较野生株提高了约24.7%。（4）对多酶复合体优化细胞代谢通路的机制进行了分析，发现高产菌株中糖基转移酶的相对表达水平有不同程度的增加，并且负责糖前体合成的三个典型基因pgmG、ugpG和rmlA的表达量也有所增加，说明可能有更多的糖前体被合成并参与到威兰胶的合成过程中来。不同的融合顺序会导致酶活力的不同，进而导致威兰胶的化学组成有所区别。本研究将有助于该鞘氨醇胶在石油开采、食品等多个领域的应用，推动代谢酶空间组织工程方法在代谢工程中的普遍应用。