CD4+CD25+调节性T细胞对肿瘤干细胞的影响及其调控机制研究

肿瘤微环境对于肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞（CSCs）的调控，在肿瘤的进展、转移和治疗反应中发挥重要作用，因此探讨肿瘤微环境对肿瘤干细胞的调控作用及机制，对于改善肿瘤治疗效果具有重要意义。肿瘤微环境中的CD4+CD25+调节性T细胞（Tregs），被认为是肿瘤免疫抑制的主要机制之一，但其对于肿瘤干细胞的影响目前尚未见报道。本研究主要探讨调节性T细胞对于乳腺癌干细胞数量及功能的影响；在此基础上验证TGF-β诱导的上皮间质转化（EMT）或Smad信号通路，是否为Tregs调控CSCs的主要机制；同时，探讨干扰TGF-β的靶向治疗与化疗联合应用，是否可以提高肿瘤治疗的效果，并成为肿瘤治疗的新策略之一。总之，通过本项目验证肿瘤微环境中的调节性T细胞，在影响肿瘤干细胞的数量及功能，进而影响肿瘤进展当中的作用，从而为研究Tregs在肿瘤进展中的作用提供新的机制，并在此基础上为开发新型治疗策略提供依据。

肿瘤微环境对于肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞的调控，在肿瘤的进展、转移和治疗中发挥重要作用，因此探讨肿瘤微环境对CSCs的调控作用及机制，对于改善肿瘤患者预后具有重要意义。肿瘤微环境中的调节性T细胞，被认为是肿瘤免疫抑制的主要机制之一，但其对CSCs的影响目前尚未见报道。本研究主要探讨Tregs对于乳腺癌CSCs数量及功能的影响；在此基础上验证TGF-β1诱导的上皮间质转化是否是Tregs调控CSCs的主要机制。方法：1.收集乳腺癌组织标本104例，应用免疫组化检测标本中Tregs和ALDH1阳性细胞的数量，分析与临床病理特征之间的联系以及两者之间的相关性。2.免疫磁珠法分离乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+Tregs，与乳腺癌细胞株MCF-7和BT474共孵育。检测共孵育前后EMT相关标志物及转录因子表达的变化。细胞划痕实验和transwell侵袭实验评价细胞迁移和侵袭能力的变化。流式细胞术、real-time PCR和western blot分别检测BT474细胞中CSCs细胞比例以及ALDH1基因和蛋白表达的改变。体外微球培养和微球连续传代实验检测Tregs对BT474细胞中CSCs样细胞数量和自我更新能力的影响。裸鼠异种移植瘤模型评价Tregs对乳腺癌细胞体内成瘤能力的影响。3.利用TGF-β1受体小分子阻滞剂阻断TGF-β1通道评价TGF-β1在Tregs调控乳腺癌细胞EMT和干性特征中的作用。建立肿瘤细胞与Tregs的隔离培养和共培养体系来探讨Tregs发挥作用的方式。结果：1.38.5%的乳腺癌标本可见ALDH1蛋白的表达，在低分化肿瘤、雌激素受体阴性、孕激素受体阴性及三阴性乳腺癌患者中含有较多的ALDH1+细胞。Tregs在分化程度较低和有淋巴结转移患者中数量较多。且两者之间存在正相关性。2.与Tregs共孵育后BT474细胞间质性标志物表达增高；MCF-7细胞上皮性标志物表达降低，间质性标志物表达增高。EMT相关转录因子Slug的表达以及细胞迁移和侵袭能力在两组肿瘤细胞中都明显上调。BT474细胞中CSCs样细胞比例，体外微球形成、自我更新能力以及小鼠体内致瘤能力增强。3.阻断TGF-β通路可以阻断Tregs诱导的乳腺癌细胞EMT和干性增加。共孵育组上清中TGF-β1浓度稍高于对照组。免疫荧光显示Tregs表面可见TGF-β1表达。