沈抚污灌区广宿主石油烃代谢质粒的分离及其介导的生物修复作用研究

目前，污染环境生物修复的主要方式为从实验室分离高效功能微生物并投加到环境中。但由于与土著微生物的营养和空间竞争，往往导致接种的高效降解菌很难存活，从而不能持久发挥生物修复作用。接种携带降解基因的广宿主（Broad host range, BHR）质粒，有可能成为解决上述"瓶颈"问题的有效手段之一。随着BHR质粒在环境中的水平基因转移，可使具有竞争性的土著微生物获得降解能力，从而不必考虑供体菌的存活条件。.沈抚灌区是我国面积最大的石油污水灌区，灌区土壤经长年接触石油烃污染物，为分离BHR代谢质粒资源提供了一个天然库藏。本项目将采用"三亲配对外源分离法"，从灌区土壤中分离BHR石油烃代谢质粒，并通过全序列测定和比较基因组学研究构建遗传进化关系；同时通过实验室微宇宙模拟实验探讨BHR质粒介导的生物修复作用。本研究对进一步扩展BHR代谢质粒的数据库信息、探索新的污染土壤生物修复途径具有重要意义。

广宿主质粒介导的水平基因转移是细菌适应环境选择压力并加速污染物代谢的重要机制。但由于分离方法和全基因组测序成本的限制，目前被分离和鉴定的广宿主代谢质粒为数不多。.本研究采用“三亲配对外源法”，从我国面积最大的石油污水灌区-沈抚灌区的土壤、底泥和水样中共计分离到8个广宿主质粒。对其进行抗生素抗性检测，无抗性选择标记的质粒采用pUTminiTn5质粒进行标记，并转至E. coli 宿主中进行遗传操作。基于PCR方法初步分析了所分离质粒的石油烃代谢功能，质粒pS3-2G、pS7-2G、pA23-1G、pW22-3G和pA10-1C上含有编码芳香环羟化双加氧酶基因（phdA）和甲苯单加氧酶基因（touA）的片段；pA15-7G含有甲苯双加氧酶(todA)和touA基因；pS3-2C含有苯双加氧酶(ben)、phdA和touA基因；pS4-6G仅含有phdA基因。宿主范围检测表明除质粒pS3-2C，其余7个质粒均可在Proteobacteria α-、β-、γ- 亚纲的代表性菌株Agrobacterium tumefaciens C58、Cupriavidus necator JMP228、E.coli EC100间进行转移并稳定传代。.采用Illumina Hiseq2000高通量测序平台，对所分离质粒进行了全基因组扫描分析，结果表明质粒pS4-6G、pA15-7G和pS3-2G具有典型的IncP-1 β质粒骨架基因，与已报道的pB3质粒骨架基因较相似；质粒pS7-2G和pW22-3G具有典型的IncP-1ε质粒骨架基因，分别与已报道的pKJK5和pAKD25同源性较高；而质粒pA23-1G的骨架基因和排列方式与新定义的PromA质粒家族亲缘关系较近，这一族包括的质粒有pMOL98、pIPO2、 pSB102 和 pTER331。.采用实验室微宇宙实验，初步探索了广宿主代谢质粒所介导的生物修复作用，结果表明通过添加营养液和调整含水量，质粒pW22-3G在土壤中的接合效率可达到 0.38×10-2，培养6周时可使土壤中添加的菲降解84.3%；pS3-2G在土壤中的接合效率可达到 0.24×10-2，培养8周时可使土壤中的总石油烃降解85.7%。.本研究对扩展广宿主代谢质粒的数据库信息具有重要意义，同时也为研究通过接种广宿主质粒介导的生物修复应用提供了基础及遗传材料。