威氏海链藻几丁质脱乙酰酶TwCDAs在壳聚糖生物合成中的调控机理研究

Chitin is an important exopolysaccharide produced by Thalassiosira, and chitosan is its main derivative. The crucial enzyme catalyzing this conversion is chitin deacetylase (CDA). Unlike the fungi, insects and crustacea, diatoms synthesize β-chitin, which has parallel chain segments and is presumed to be easy to obtain chitosan with high activity, owing to its better reactivity, swelling, and solubility. T. weissflogii was investigated to be one of the most important natural producers of chitin and chitosan, higher than T. pseudonana and T. rotula. In this project, gene transformation, transcriptome sequencing, metabolites analysis and enzymatic characterization will be used to elucidate the function and biochemical features of the crucial gene responsible for chitosan biosynthesis in T. weissflogii. The main contents include: (1) Compare the subcellular localization of TwCDA1 and TwCDA2 to explore if the two CDAs have different cell compartmentations, and study their influence on cell division; (2) Investigate the regulatory effects of TwCDAs on the synthesis of chitosan and sugar/acid metabolism network via combined analysis of transcriptomes sequencing and metabolites contents; (3) Explore the enzymatic activity of TwCDAs on various substrates such as chitin oligomers and deacetylated chitin, after the purification through GFP-Trap beads. The expected results of this project will elucidate the functional and biochemical characteristics of TwCDAs from the aspects of gene, protein and metabolites. This will be instructive for understanding the role of chitin deacetylase and chitosan in the sugar/acid metabolic network, and further provide a theoretical basis for the application of TwCDA in the enzymatic synthesis of chitosan.

甲壳素是海链藻属（Thalassiosira）硅藻合成的一种重要胞外多糖，壳聚糖是其最主要的衍生物，被广泛应用于农业、纺织、食品、化妆品及医学领域。催化壳聚糖生物合成的关键酶为几丁质脱乙酰酶（Chitin deacetylase, CDA）。与真菌、昆虫、甲壳类动物不同，硅藻中的甲壳素为糖链同向平行的β型，更易脱乙酰获得高生理活性的壳聚糖。从威氏海链藻入手，发掘甲壳素高合成能力的藻种，进而筛选髙活力的CDA酶（TwCDA）并阐释其生物学功能，是本项目的主要研究内容，具体包括：（1）通过TwCDAs亚细胞定位，比较TwCDA1与TwCDA2是否进入不同细胞区间发挥协同作用及其对细胞分裂的影响；（2）结合转录组测序与代谢组分析，探讨TwCDAs对壳聚糖合成及糖酸代谢网络的调控作用；（3）通过分离TwCDAs，完成TwCDAs对壳聚糖底物的催化活性分析，发掘髙活力几丁质脱乙酰酶。预期研究结果将从基因、蛋白、代谢物各层面阐释海链藻壳聚糖合成关键酶的作用机理及生化特性，为揭示壳聚糖在海链藻糖酸代谢网络中的地位提供参考，丰富海洋高值活性物质来源，也为几丁质脱乙酰酶的体外应用提供理论基础。

硅藻是海洋初级生产力的重要贡献者，也是海洋中含量最高的含氮多糖—甲壳素新陈代谢的重要载体，在海洋碳氮物质循环中起关键作用。硅藻甲壳素代谢通路尚不清晰，关键基因作用机理不明确，硅藻源高值生物酶的开发有限。本项目同时开展了硅藻甲壳素代谢酶几丁质脱乙酰酶（TwCDAs、TpCDA、PtCDA等）、几丁质合酶（TpCHS）及几丁质酶（Chi）的功能验证和机理解析。研究内容包括：（1）通过基因枪轰击完成硅藻CDAs和CHS基因转化，观察重组蛋白定位，分析其对细胞分裂的影响；（2）整合野生型及过表达藻株的叶绿素荧光参数、转录组及代谢组数据，解析CDA、CHS引起的生理生化变化及对糖酸等代谢通路的影响；（3）通过CDA、CHS在三角褐指藻及酿酒酵母中过表达，分离重组蛋白检测其对甲壳素底物的催化活性，完成酶活分析，筛选高活力几丁质脱乙酰酶和几丁质合酶。主要结果包括：（1）中心纲硅藻的甲壳素代谢途径比羽纹纲硅藻复杂，14C同位素标记GlcNAc进行体外酶活分析，发现海链藻CHS具有催化甲壳素糖链合成的作用，CDA重组酶可催化甲壳素五聚物寡糖及不同乙酰化长链甲壳素的降解，可作为后续酶解法重要来源；（2）海链藻Chi基因家族依据进化地位可分为8个不同群组，各基因在mRNA水平响应胁迫处理但几丁质酶活保存稳定，表明几丁质降解过程存在转录后调控，有利于海链藻适应多变的生存环境；（3）威氏海链藻的全长转录本测序共获得25,412个基因，其中包含234个编码甲壳素代谢相关酶的基因，为威氏海链藻的分子水平研究提供参考信息库，也为高值酶的开发利用提供重要基础。本项目分别从基因家族生信分析、胁迫处理对mRNA及酶活影响、CHS和CDA转基因遗传操作、过表达株系生理生化指标检测、转录组和代谢组关联分析等多方面对硅藻甲壳素代谢机理进行探索。相关组学高通量测序数据为硅藻分子研究提供了背景信息，基因功能验证为甲壳素代谢酶在海链藻碳代谢网络中的地位及调控机理提供参考，酶学分析为硅藻β-甲壳素高值衍生物开发利用奠定了基础。