基于多酶调控的Alcaligenes sp.合成威兰胶的代谢工程研究

威兰胶是一种结冷胶类微生物多糖，在采油和高品质建材领域有广阔应用前景。本课题以一株高产威兰胶的具有自主知识产权的Alcaligenes sp. CGMCC2428为对象，研究与糖核苷酸合成和单糖连接有关的三个关键酶RhsA、PgmG、GelK及其基因，将这三种基因分别和组合导入目的菌株中，以实现高效表达。对构建的基因工程菌和出发菌的代谢通量进行计算和比较，设计最优的代谢工程操作方案，实现多酶及其代谢途径的有效调控，最终达到最高威兰胶产率和转化率的目的。该研究对揭示微生物合成威兰胶的代谢机理，从而提高威兰胶合成效率，促进结冷胶多糖生产技术的发展，具有重要的学术意义和实用价值。

威兰胶是一种重要的结冷胶类微生物多糖，它以其分子结构多样性、独特的物理学和流变学特性以及使用安全性，在工业生产和生活的许多领域具有广泛的应用价值。由于受到生产率低下，生产成本昂贵，合成机制不清楚等诸多问题的影响，导致生产水平不高，限制了威兰胶类多糖大规模产业化发展。.本研究以一株威兰胶生产菌Alcaligenes sp.为研究对象，采用基因工程和代谢工程技术，首次对威兰胶生物合成机理展开研究，揭示了微生物合成威兰胶的代谢机理，从而提高威兰胶合成效率。丰富了结冷胶类多糖合成的分子生物学信息，为结冷胶类多糖菌种代谢工程改造，促进这类多糖生产技术的发展，有重要的经济价值。研究工作主要如下：.1、通过兼并引物设计，克隆出编码威兰胶糖苷酸前体合成途径关键酶基因，并对这4个关键酶编码基因进行基本特性分析，发现这4个关键酶基因均与鞘氨醇单胞属相似性最高。.2、通过分子生物学手段克隆构建含编码威兰胶糖苷酸前体合成途径关键酶基因的质粒，将其转化入目的宿主，考察编码基因的表达情况及其编码的相关酶的性质。.3、进一步构建威兰胶合成能量代谢途径，解析了菌体能量代谢对威兰胶合成的重要影响。.4、通过人工添加外源物质强化多酶调控的威兰胶合成途径，使得威兰胶合成能力大幅提高。.5、人工选育工业理想型威兰胶高产菌株，并解析菌株多酶调控机制，实现低成本高效率威兰胶合成，能够更好的满足工业生产需求，极大节约工业过程能耗和生产成本。