O-糖基化与磷酸化对胰岛素受体信号传递的影响

糖尿病及其并发症己成为威胁人类健康的主要慢性疾病之一，该病的发病机理与胰岛素受体信号通路密切相关。本项目拟结合化学合成、分子生物学和细胞生物学的相关方法研究胰岛素受体信号通路中的两种重要靶蛋白IRS-1、AKt，探讨糖基化和磷酸化的相互影响及其对胰岛素受体信号传导通路的调控。.项目首先应用荧光标记的UDP-GlcNAc、放射性同位素标记的ATP，探讨磷酸化/O-GlcNAc修饰对PI3K-Akt信号通路中关键蛋白IRS-1、Akt的功能影响；然后应用磷酸化/O-GlcNAc修饰相关酶的特异抑制剂、同位素标记葡萄糖和RNAi核酸等分子探针，研究3T3-L1脂肪细胞中Akt/IRS-1蛋白磷酸化/O-GlcNAc修饰对细胞糖代谢的影响。通过上述实验对胰岛素受体信号传递途径进行深入研究，为糖尿病等重大疾病的发生机理及其靶向治疗提供科学依据。

O-GlcNAc糖基化修饰是近年来发现的一种重要的蛋白质翻译后修饰，受N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)调控。OGT以UDP-GlcNAc为糖基来源，通过β-O-糖苷键将GlcNAc基团连接到底物蛋白的丝氨酸或苏氨酸上，OGA则负责移除该修饰。AKT和GSK3（α/β）是胰岛素受体信号通路PI3K-AKT的下游节点重要信号分子，调节着Glut4的转位和葡萄糖的摄入，同时通过影响糖原合成酶的活性，控制着糖原的代谢。利用分子生物学和生物化学方法，课题组首先克隆、表达、纯化并鉴定了O-GlcNAc修饰酶（OGT和OGA）、胰岛素受体信号途径关键酶（AKT和GSK3β）；然后根据OGT、OGA、GSK3β的晶体结构和催化机理，利用有机化学合成和酶促生物合成的方法，合成了大量对应酶类的底物类似物、抑制剂、激活剂；通过体外和体内酶学测试，我们获得了其对底物识别的机制；利用26种UDP-GlcNAc衍生物、OGT和OGA，我们获得了4种只被OGT转移而不被OGA所水解的UDP-GlcNAc衍生物。将对应葡萄糖胺衍生物饲喂细胞(293T)后发现，细胞中的O-GlcNAc糖基化水平大大提高。利用小鼠脂肪细胞3T3L1，以OGA抑制剂Thiamet-G为对照，我们分析了探针Ac4-GlcNAc-F3对胰岛素受体信号途径的影响。发现：该探针可提高AKT、GSK3（α、β）的蛋白水平，并降低对应的磷酸化水平。总之，本项目利用化学生物学的方法, 合成、筛选了O-GlcNAc调控中的分子探针，以胰岛素受体信号传递途径为模型，分析了该类探针对信号途径中关键分子AKT、GSK3（α、β）蛋白水平和磷酸化水平的影响，探索了该信号途径中的分子事件与规律，为糖尿病的发病机制研究提供了有效工具和方法学。