系统性探索不同N-glycan修饰对Interferonβ活性和稳定性影响

N-Glycosylation is one of the most prominent post-translational protein modifications and plays a role in various cellular functions including protein folding, sorting, and stability andcell-cell interactions. Naturally occurring N-glycoproteins exhibit glycoform heterogeneity with respect to N-glycan sequon occupancy (macroheterogeneity) and glycan structure (microheterogeneity). Biofunctional studies of N-glycans on proteins thus remain challenging tasks due to the complexity, diversity and low abundance of these glycans. We have developed an efficient chemoenzymatic strategy, namely Core Synthesis/Enzymatic Extension (CSEE), for rapid production of diverse N-glycans..More recently, our group developed a novel enzymatic approach for facile production of glycopeptides carrying natural eukaryotic N-glycans. In this approach, peptides can be GlcNAcylated at one or two natural N-glycosylation sites via two-step enzymatic reactions catalyzed by an evolved N-glycosyltransferase (ApNGTQ469A) and a glucosamine N-acetyltransferase (GlmA), respectively. The resulting GlcNAc-peptides were further modified by an endo-b-N-acetylglucosaminidase M mutant (EndoMN175Q) to generate glycopeptides. In three steps of enzymatic catalysis, glycopeptides carrying complex-type N-glycans can be efficiently synthesized. In this application, we plan to synthesize 100 abundant N-glycans, which will be conjugated to Interferon β. Next, the activity and stability of the corresponding glycoprotein will be systematically investigated.

N-蛋白糖基化是最复杂的蛋白翻译后修饰现象之一，细胞中的N-糖蛋白存在着巨大的不均一性/多样性，包括糖基化位点不均一性和N-glycan结构的不均一性。当前，尽管蛋白糖链的分析技术在已经获得了长足的进步，然而，不同结构N-glycan功能的研究却远远滞后。2015年，我们结合有机合成和酶催化发展了对结构非对称N-glycan的CSEE合成方法。于2017年利用我们课题组改造的新型N-糖基转移酶ApNGTQ469A，协同GlcN乙酰基转移酶GlmA，进一步开发了合成N-GlcNAc修饰糖肽/蛋白的方法，并合成了一系列N-GlcNAc修饰多肽。本申请中，我们将合成高丰度的100种人N-glycan物质库。并利用酶法将其连接到GlcNAc修饰的IFNβ上，系统地测试不同N-glycan结构对IFNβ活性和稳定性的影响。

N-糖基化是最突出的翻译后蛋白质修饰之一，在各种细胞功能中起作用，包括蛋白质折叠，分选和稳定性以及细胞-细胞相互作用。大多数人类蛋白质通过约200个基因组编码的糖基转移酶的竞争作用被糖基化，并表现出多种糖形式，这致使细胞中的N-糖蛋白存在着巨大的不均一性/多样性，因而糖蛋白的分离和结构功能研究构成巨大的挑战。脱酰胺现象作为一种常见的蛋白质自发降解途径，在制药工业中受到普遍关注；在一些情况下，脱酰胺作用导致蛋白质/肽类药物功效和货架期的降低。在本项目中我们结合之前报道的有机合成结合酶催化的核心合成/酶延伸策略合成了一系列的N-糖苷和噁唑啉修饰的N-糖苷。然后我们通过N-糖基转移酶(ApNgTQ469A)和葡萄糖胺N-乙酰基转移酶催化的两步酶促反应对β干扰素的天然的N-糖基化位点进行GlcN-酰化，得到N-乙酰氨基葡萄糖修饰的β干扰素。所得到的GlcNAc修饰的β干扰素在内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶M突变体(EndMN175Q)催化下进一步与噁唑啉修饰的N-糖苷反应产生一系列的N-糖苷β干扰素，并对其活性和稳定性进行测试实验。除此之外，我们通过其他的实验结果发现多肽或蛋白质脱酰胺位点恰好发生在天冬酰胺上，多肽的N-糖基化可以显著减少自然发生的脱酰胺反应。特别注意的是在治疗肽INGAP-P上经过N-糖基化修饰后也增加了INGAP-P的去酰胺化半衰期及其治疗效果。我们还发现了其他两种不同来源的葡萄糖胺N-乙酰转移酶RmNag、Naa10p，为本项目氨基葡萄糖的N-乙酰化提供了新的酶催化合成路径。我们研究了糖基转移酶标记辅助质谱(GLAMS)在糖肽水平上识别唾液酸化特异性连接，另一方面是开发了一种在毕赤酵母中制备均质的N-GlcNAc重组蛋白的方法。这些研究成果为本课题制备均质糖肽、研究不同N-糖苷结构对β干扰素活性和稳定性的影响具有密切相关性和指导意义。