新型膜孔蛋白OmpF突变体的生物学特性及其对氨曲南转运机制的研究

Owing to OmpF is the main channel allowing antibiotic to go through, decreasing expression or nucleic acid sequence mutating of ompF gene is the most important mechanism to cause resistant for bacteria. However, we found an OmpF mutant（GenBank number: JX393912）in a former investigation and increasing susceptibility for Aztreonam was observed in some producing ESBLs proteus mirabilis clinical isolates carrying this ompF mutatant gene. Our aim is to clone and expression this ompF mutant gene by Homologous recombination technology. Then biological properties will be determined and Aztreonam transport mechanism will be analysed by computer modeling. Our finding will contribute to produce novel antibiotics against resistant bacteria.

膜孔蛋白OmpF是多种抗菌药进入细菌的主要通道，它的表达水平下调或氨基酸位点突变是导致细菌产生耐药的重要机制。然而，申请者在前期研究中首次发现了一种新型OmpF突变体（GenBank登录号JX393912），它在临床分离的产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）奇异变形杆菌中正常表达不但没有引起耐药性的显著升高,反而表现对氨曲南高度敏感。本研究拟通过同源重组技术，获得表达新型OmpF突变体的克隆株，根据生长曲线、时间-杀菌曲线、最低抑菌浓度、氨曲南渗透速率和单通道传导试验的测定，全面了解其生物学特性；拟通过同源建模技术，构建新型OmpF突变体结构的计算机模拟，并结合生物学特性，推测新型OmpF突变体的不同结构在氨曲南转运过程中所起的作用。本课题有助于了解新型OmpF突变体对氨曲南通透性大幅提高的机制，为将来针对多重耐药细菌的新药研发提供依据。

膜孔蛋白OmpF是多种抗菌药进入细菌的主要通道，它的表达水平下调或氨基酸位点突变是导致细菌产生耐药的重要机制。然而，申请者在前期研究中首次发现了一种新型OmpF突变体（GenBank登录号JX393912），它在奇异变形杆菌中正常表达不但没有引起耐药性的显著升高,反而表现对氨曲南高度敏感。本研究通过RED同源重组技术，成功获得ATCC 29906的OmpF缺失株和表达新型OmpF的突变株，生长曲线显示OmpF缺失株相对于野生株生长更为缓慢，突变株的生长情况相比于缺失菌株加快，但低于野生株。药敏结果显示突变株对氨区南等多种抗生素均十分敏感。HPLC结果显示野生株对氨曲南的渗透率为0.19%，对缺失株为0.13%，对突变株为0.25%，所以，新型OmpF的表达可以增强细菌对氨曲南的摄取能力。另外，我们使用分子动力学软件包Gromacs 5.0对野生株和突变株分别进行了计算机同源建模，结果表明突变株确实会降低钾离子和氯离子的传导所需要跨过的最高能垒。由于我们的计算显示，突变对阴阳离子都有加速作用，情况都与氨曲南近似，因此这些结果非常具有参考价值。这意味着，突变会加快离子的传导速度，这与氨曲南的透过能力增强的实验结果吻合。上述研究成果从生物学特点和计算机结构建模两个方面，论证了奇异变形杆菌OmpF新突变体确实可以提高对氨曲南的通透性，由于该突变体来自于临床菌株而非实验室改造菌株，所以上述结果为进一步研发出针对耐药菌治疗的有效药物提供了宝贵的理论依据。