土槿皮乙酸抑菌活性构效关系及其作用机制研究

Screening fungicidal compounds from plants is one of the important ways to create new fungicides. Pseudolaric acid B (PAB), isolated from the root bark of Pseudolarix kaempferi Goeden found only in China, has been used traditionally as anticarcinogen and medical antifungal agent. In the course of our previous screening for novel botanical fungicides, PAB was found to exhibit strongly inhibition against Colletotrichum Glogesporioides Penz and the other 15 plant pathogenic fungi in vitro and in vivo. However, further study about the quantitative structure activity relationship （QSAR） and mechanism of action of PAB are kept unknown. In this project, structural optimization, fungicidal activity, QSAR and the activity mechanism of PAB will be performed in order to obtain better active compounds and reveal the target against pathogenic fungi. The research results described above will provide a basis for design and innovation of fungicides with new mechanisms of action.

研究植物源杀菌剂是目前创制新型杀菌剂的重要途径。我们从中国特有植物金钱松的根皮中分离获得一种高活性的农用抑菌物质土槿皮乙酸（PAB），该物质对芒果胶孢炭疽菌等多种植物病原真菌很强的离体及活体抑菌作用。PAB作为一个天然农用抑菌先导化合物，其构效关系、抑菌机理尚不明确。本项目采用现代化学合成手段对天然抑菌物质Pseudolaric acid B（PAB）进行结构修饰，测定其衍生物的抑菌活性，建立化合物与活性之间的定量构效关系（QSAR）模型，探讨其理想的高活性分子模型，以此为基础合成2-3个具产业化开发前景的高活性化合物；并以PAB和高活性衍生物为研究对象，从细胞学、酶学和分子生物学等角度研究PAB的抑菌机理。研究结果将为PAB及其衍生物作为植物源杀菌剂产品开发奠定基础，为生物合理设计创制新农药提供理论依据。

本研究按照项目计划，主要完成了两个方面的内容：（1）Pseudolaric acid B（PAB），PAB类似物及其衍生物的抑菌活性研究。采用活性追踪法，从土槿皮乙醇提取物中分离获得8个单体化合物并比较了其抑菌活性；合成了21个PAB衍生物，其抑菌活性均低于母体化合物PAB，未能通过结构改造提高其抑菌活性，这和医用研究而结果一致；抑菌谱测试表明，PAB对芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等11种植物病原真菌均有显著的抑菌活性，主要表现为抑制菌丝生长，对孢子萌发抑制作用较弱；芒果浸果试验结果表明，100 mg/L PAB处理对芒果采后炭疽病的治疗作用为87.6%，优于同浓度的多菌灵（CBM）处理（63.4%）。（2）PAB抑菌作用机理初步研究。PAB处理可导致芒果炭疽病菌菌丝体及生长点畸形膨大，不规则分枝，表面附着外渗物，部分菌丝干瘪、塌陷；透射电镜观察发现PAB处理后的芒果炭疽病菌菌丝体细胞内含物外渗，细胞膜完整性被破坏，部分细胞呈空腔状；进一步试验发现PAB处理可导致菌丝体细胞膜透性增加；除几丁质含量有所降低外，对细胞壁其他重要组分及其酶活力影响不显著；上述研究表明PAB的抑菌作用可能与对细胞膜的影响有关，运用RNA-seq技术对芒果炭疽病菌经PAB和CBM诱导前后的转录组进行了测定和分析，并对测序结果进行了QPCR验证。对测序结果进行GO和KEEG分析发现，PAB处理后甾醇生物合成通路中5个基因被上调或者下调，其中麦角甾醇合成途径中的ERG24和ERG25基因分别被下调1.3和1.6倍，ERG6基因被上调1.6倍，这可能导致麦角甾醇合成受影响。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要结构组成成分，其合成被干扰或阻断可破坏真菌细胞膜结构，导致真菌生长异常甚至死亡。由此，我们推测甾醇生物合成可能是PAB抑菌作用的主要生化途径，PAB可能通过影响菌体中麦角甾醇生物合成通路中关键酶而起作用，但尚需要深入的研究来证实。