硫化氢调节一氧化氮合成和蛋白质巯基亚硝基化延缓血管老化的实验研究

Senescence usually accompanied with the increased formation and decreased removal rate of oxygen free radical, the abundant accumulation of oxygen free radicals will damage the endothelial cells and lead to the diseases which related to vascular endothelial dysfunction. In prior study, the applicant found that the third gas molecular, hydrogen sulfide (H2S), can postpone the aging process by anti-oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells. The role will be further studied in this project. We will explore the specific mechanisms of H2S against the aging process of endothelial cells including changes of synthesis and release of endothelial NO, the uncoupling of eNOS (endothelial NO synthase) and NO-based protein S-nitrosylation in overall level and cell level. This study will identify the effective protection of H2S on vascular endothelial cells from endothelial dysfunction and the aging process of blood vessels, and supply new therapeutic strategies and ideas on clinical treatments of diseases which related to aging process of blood vessels.

机体衰老时伴随着机体内氧自由基的生成增多和清除能力减低，氧自由基的过量积累会损伤血管内皮细胞的功能，加速血管老化并诱发内皮细胞功能障碍相关的疾病。申请者前期在细胞水平的研究发现，硫化氢（H2S）能通过抗氧化应激作用延缓培养的人脐静脉内皮细胞的老化进程。本项目拟在原有研究的基础上，以H2S调控内皮细胞氧自由基水平为切入点，从整体水平和细胞水平深入研究H2S延缓内皮细胞老化的机制，并从内皮细胞NO的合成和释放、NO合成酶eNOS脱偶联水平和以NO为基础的蛋白质巯基亚硝基化三个方面的变化进行阐述。本研究将明确H2S是否能有效的保护血管内皮细胞功能、减少内皮细胞功能障碍的发生，从而延缓血管老化过程，并为血管老化相关疾病的临床治疗提供新的治疗策略和思路。

人口老龄化是我国目前面临的较严重的社会问题之一，衰老往往伴随着血管功能的异常。因此，寻找能够保护内皮细胞功能、延缓或逆转血管老化进程的有效生物学靶点是基础研究和临床实践亟待解决的重大问题之一。本项目重点研究了硫化氢（H2S）对血管老化的影响及其相关机制。研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）制作衰老细胞模型，通过H2S预处理和后处理，观察H2S对内皮细胞衰老过程的影响及机制；采用D-半乳糖处理制备大鼠衰老动物模型，观察H2S对血管老化过程的影响及机制。.主要结果如下：.(1)H2S预处理能减轻细胞内的氧自由基水平，抑制老化过程中内皮细胞内的黄嘌呤氧化酶（XOD）、p67phox表达的增加和超氧化物歧化酶的产生；H2S预处理可以抑制eNOS的脱偶联，降低eNOS的单体含量，使eNOS维持在二聚体状态，增加NO的生成，从而调节NO在老化过程中的生物利用，延缓HUVECs老化的作用。.(2)H2S预处理通过上调HUVECs老化进程中去乙酰化酶SIRT1 的mRNA和蛋白表达，减少acetyl-p53的累积，从而抑制细胞周期相关蛋白p21的表达，进而增加真核细胞转录因子E2F-1的释放，减少细胞G1期阻滞，促进细胞增殖来延缓人脐静脉内皮细胞的老化。.(3) H2S预处理通过下调p38MAPK信号通路调节Bax、Bcl-2、cyt-c、Caspase-9/3的表达，减少细胞凋亡，从而起到延缓人脐静脉内皮细胞老化的作用。.(4) H2S后处理增加SIRT1 mRNA和蛋白的表达，逆转NAM诱导的细胞衰老，提示H2S后处理通过SIRT1信号通路发挥其抗细胞衰老的作用。.(5) H2S可以降低血浆AngⅡ的浓度，下调主动脉AT1R蛋白的表达，增强血管组织抗氧化应激的能力；增加TIMP-2、TIMP-1蛋白的表达，抑制MMP-2、MMP-9蛋白的活性，调节MMPs／TIMPs的平衡，从而最终降低衰老大鼠血管的僵硬度，减少血管重塑，延缓血管老化的发生。.我们的实验研究结果表明，H2S能够对抗血管内皮细胞和血管的衰老进程，为延缓血管系统共和机体的衰老提供了相关思路，并为衰老相关的心血管疾病防治的临床实践提供可靠的科学依据。