抗N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎特异抗体对Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB在记忆缺失中作用及机理的研究

Autoantibodies to the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor have been associated with a recently described autoimmune encephalitis named anti-NMDA receptor encephalitis. This encephalitis is now known as a disorder with high morbidity and difficult to be differentiated with viral encephalitis. Currently, the underlying mechanism by which anti-NMDA receptor specific antibodies cause characteristic memory deficit is poorly understood. In the present study, we plan to investigate the effects of anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis specific antibodies on Ca2+/CaM-CaMKII-CREB pathway with hippocampus neurons and slices in vitro and rat model in vivo，which may be of great significance in elucidating the possible mechanism of memory deficit in this entity. All the researches in this study will be performed on the basis of new techniques quantifying and classifying anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis specific antibodies.

抗N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA)受体脑炎是近年发现的一种机体针对NMDA受体产生抗体所导致的自身免疫性脑炎。本病临床发病率较高，并与病毒性脑炎难以鉴别。目前，抗NMDA受体脑炎特异抗体所致特征性记忆缺失机制的研究尚不清楚。本研究在使用新型抗NMDA受体特异抗体定量及分型检测技术的基础上，采用海马神经元、脑片以及大鼠模型相结合的方案，拟初步阐明抗NMDA受体脑炎特异抗体对Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB通路的作用及机理，对揭示抗NMDA受体脑炎患者记忆缺失的机制可能具有重要意义。

抗NMDAR脑炎是常见的一类自身免疫性脑炎，主要是由于脑脊液中针对NR1亚单位的IgG抗体致病。与之相反,抗NR2亚单位抗体在多种不同疾病中检出, 因此其临床意义尚不明确。我们前期按计划完成pGEX-6p-1/NR1-ATD质粒构建，诱导表达NR1-ATD蛋白，并通过SDS-PAGE鉴定了NR1-ATD蛋白纯度。但是在课题进行过程中，另有研究显示利用工具细胞转染编码表达靶蛋白的cDNA，是检测针对细胞膜表面抗体的最新方法。因此，在后来的研究中，我们将编码NR1全长并带C 端Flag标签的质粒转染HEK293细胞造成NR1过表达。将转染后细胞透化并固定后，加入原浓度患者脑脊液和单克隆商品化抗Flag抗体，再加入对应的荧光二抗，使用荧光共聚焦显微镜拍照。此实验室内部细胞基础实验（cell based assay，CBA）有理想的敏感性及特异性，甚至不亚于商品化抗NMDAR-IgG检测试剂盒，极大降低了后续基础实验的成本。同时，我们成功的将CBA法应用到MOG-IgG、GFAP-IgG等目前尚无商品化检测试剂盒的新型神经免疫自身抗体研究中。我们在部分抗NMDAR脑炎患者脑脊液中检出了抗NMDAR-IgA 抗体。值得注意的是，高滴度抗NMDAR-IgA患者脑脊液中，其抗NMDAR-IgG滴度也较高，但其临床意义上不得而知。探索抗NMDAR-IgG作用于Ca2+/CaM-CaMKⅡ-CREB通路导致记忆缺失的机理，必须依靠膜片钳技术。尽管由于仪器方面原因，未能在课题进行期间获得膜片钳数据，但是课题组已经收集到了足量不同抗体水平的急性期、缓解期以及康复期患者脑脊液。课题进行3年中，课题组收集抗NMDAR脑炎患者样本多达354人份。课题组掌握并改进了作为盲法膜片钳前提条件的海马脑片制备。与此同时，我们掌握了作为全细胞膜片钳前提的海马锥体细胞急性分离培养。至于抗NMDAR脑炎动物模型制备，目前全世界仅有一家实验室采用被动免疫方法，即将人源性抗NMDAR-IgG注入动物侧脑室中。课题原计划中使用主动免疫，使动物自身产生抗NMDAR-IgG似乎还有较长的路要走。