三疣梭子蟹MAO和COMT基因及其多态性在攻击行为差异机制中的作用研究

Aggressive behavior, which has been widely observed in animals, is a complex multiple genes controlled and environment influenced behavior. However, the molecualr mechanism of aggressive behavior is not fully understood not only in Crustaceans but also in Invertebrates. The aggressive behavior exists in the culture of Portunus trituberculatus, which is an economically important species in China, and causes huge economic losses. In this project, aggressive behavior in Portunus trituberculatus will be further investigated by molecular and cellular biotechnologies including RACE, combinant protein, immunohistochemistry, SSR, SNP, HPLC, Western blot, quantitative Real-time PCR and so on. Full-length cDNA of key enzyme of melatonin synthesis gene MAO and COMT for 5-HT and DA will be cloned, recombination protein and antibodies will be prepared; a comparative study on the relationship between MAO and COMT the different development stages will be examined; Mechanism of aggressive behavior will be revealed by polymorphism analysis and correlation analysis between MAO, COMT polymorphism and diversity of aggressive behavior. The obtained results will supply the gap in the field of aggressive behavior on molecular level in Crustacean and provide valuable reference for understanding its genes regulation pathway. At the same time, the results will be helpful on developing molecular markers for aggressive behavior and providing theory foundation for healthy aquaculture of Portunus trituberculatus.

动物的攻击行为（aggressive behavior）是动物中普遍存在的由环境影响、多基因决定的复杂行为，然而其在甲壳动物，乃至无脊椎动物中发生和作用的分子机制尚不明确。三疣梭子蟹是我国重要的经济蟹类，养殖和育苗过程中攻击行为严重，造成巨大经济损失。本项目以三疣梭子蟹为研究对象，应用RACE、蛋白重组、免疫组织化学、Western blot、SSR、SNP、HPLC和RT-PCR等技术方法，克隆5-HT和DA代谢酶MAO和COMT的cDNA全长序列，并获得重组蛋白及其抗体；以不同发育阶段个体为研究对象，分析MAO和COMT对攻击行为作用的分子机制；通过MAO和COMT基因多态性与攻击性差异的相关性分析，揭示攻击行为发生的根本机制。研究结果将有助于阐明蟹类攻击行为的神经和基因调控通路，丰富甲壳类攻击行为分子遗传学基础，期望获得有关的分子标记用于遗传改良，并为三疣梭子蟹健康养殖提供理论指导。

本项目针对三疣梭子蟹养殖过程中攻击性行为严重，导致相互残杀减少养殖产量，且相关基础研究缺乏的问题。克隆得到三疣梭子蟹PtCOMT基因的cDNA 全长为1072 bp，5’ 非编码区（5’ UTR）为110 bp，3’ 非编码区（3’ UTR）为293 bp，开放阅读框（ORF）长为669 bp，能编码222个氨基酸组成的多肽，具有3`-端多聚腺苷酸加尾信号AATAAA 和polyA 尾巴。据推测序列编码的蛋白质分子量为24.4 kDa，理论的等电点为5.67，没有二硫键和信号肽序列，仅具有一个保守的SAM_OMT_I 结构域。经氨基酸多重序列比对及系统进化树分析表明PtCOMT氨基酸序列与其他甲壳类动物如南美白对虾、斑节对虾和中华鳖都具有高度相似性。然后，实时定量PCR结果表明在三疣梭子蟹幼体发育各时期（Z1、Z2、 Z3、Z4和M期）都有PtCOMT基因的表达，在幼体Z4和M时期PtCOMT的表达水平高于在Z1，Z2和Z3时期；利用实时定量PCR和免疫组化（IHC）技术在健康三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、神经节组织中也检测到PtCOMT的表达，神经节和肌肉组织中的表达量明显高于肝胰腺组织。COMT是DA的主要代谢酶，控制突触中DA的代谢能有效影响机体的运动，情感和认知行为。最后，本研究用多巴胺刺激三疣梭子蟹，通过行为观察蟹穿过池中间点的频数来间接评判三疣梭子蟹的运动行为强弱；用实时定量PCR和免疫印迹（Western blotting）技术检测其肌肉和神经节中PtCOMT的表达变化，结果显示PtCOMT在mRNA和蛋白表达水平都发生改变。与对照组相比，肌肉组织中PtCOMT表达水平在2 h时显著上调（P<0.05），随后在4 h显著下调（P<0.05）；在神经节中，注射2 h时，PtCOMT的表达水平显著下调（P<0.05），随后在4 h时显著上调（P<0.05），之后慢慢恢复到正常表达水平，结果表明多巴胺能促进PtCOMT的表达和释放，从而作用于三疣梭子蟹的攻击性行为。同时，我们采用了dsRNA干扰技术进一步验证其攻击性作用，用两种不同方法注射dsRNA以干扰PtCOMT基因的表达并检测了其干扰效率，初步研究结果表明不同时间点间断注射dsRNA比一次性注射有更好的干扰效果，为进一步研究PtCOMT在甲壳动物攻击性行为中的分子机制作铺垫。