固定化细胞成膜与环境抗性的机制探索

Our previous study indicated that microbial cell like Saccharomyces cerevisiae immobilized on the surface of fiber carrier could form a highly structured and systematic microbial film, and as a whole show a series of new biological characteristics. The microbial cell exhibits a strong ability to adapt to the environment, such as the cells are significantly improved the product and substrate tolerance. Therefore this technology has the excellent industrialization prospect. However the mechanism of biofilm formation and how biological membrane structure affect microbial environment resistance is still not clear. In order to resolve these scientific problems, we intend to use confocal laser scanning microscopy combined with fluorescence marker technology and staining technique for real-time observation biofilm formation process of the adhesion, development and mature to investigate the effects of cell membrane components and the three dimensional structure on the enhancement of cell environment resistance. Then the microbial cells and dielectric surface interaction of two-way adjustment function between cell environment signal response system and quorum-sensing system are clerified from transcription group level and proteingroup level in the process of cell accumulation menbrane. The solution of above scientific problems will be helpful to elucidate the molecular mechanism of biofilm formation. On the basis of above theory, relavant carrier and reactor are designed reasonably, and the theoretical foundation of an effective surface immobilized strategy is established. Thereby the new technique of immobilization will break through.

我们前期的研究发现酿酒酵母等微生物细胞固定于纤维介质表面时能够形成高度组织化、系统化的微生物膜，并且在整体性上表现出一系列新的生物学特征，并显示出更强的环境适应能力，细胞对产物、底物的耐受性均大幅提升，展现出了非常好的工业化前景。但是目前对于生物膜形成以及生物膜结构如何影响微生物环境抗性的机制研究尚不明确。本项目拟采用共聚焦激光扫描显微技术结合荧光标记、染色实时观测生物膜形成的黏附、发展、成熟过程，考察膜的组分、三维结构对细胞环境抗性增强的影响，从转录组水平、蛋白组水平等多组学角度出发阐明细胞聚集成膜过程中细胞环境信号应答系统、群体感应系统在微生物细胞与介质表面相互作用时的双向调节作用。上述相关科学问题的解决将有助于阐明生物膜形成的分子机理，并以此为依据，合理设计相关介质及反应器，为建立有效的表面固定化策略奠定理论基础，实现固定化技术新的突破。

由于环境污染和石油价格攀升等问题，发酵法已经越来越多的被用在大宗化学品和生物燃料的生产上。目前，该方法最主要的问题是如何高效低成本地用微生物将糖转变为醇，主要关注细胞在高醇环境中的耐受性、生物转化的时空效率以及连续化自动化生产等问题。细胞固定化技术可以很好地改善或者解决这些问题。但是目前的研究还只限于工业应用，对其固定化机制仍然不是很明了，限制了其进一步的发展和应用。本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为研究对象，基于酵母在固定化的过程中生物膜的形态和组分发生的变化，通过转录组测序的方法对成膜的关键基因进行深度挖掘和筛选，并且对相关的成膜关键基因进行敲除和一系列的表型验证实验，同时，对酵母固定化发酵条件进行优化，并实现工业化生产。研究发现酵母生物膜的主要成分是多糖。基于之前的组分分析，重点关注多糖代谢的相关调控基因，发现了flo家族基因、糖异生途径的基因以及葡萄糖效应相关的调控基因发生明显的表达差异，并且提出了Mig1——糖异生——生物膜这一新的假说。对相关多糖基因进行敲除，发现在平板成膜能力，invasive growth analysis，乙醇耐受性，酵母细胞沉降以及细胞凋亡等方面与野生菌有明显区别，进一步说明了这一类基因是酵母生物膜形成的关键。同时，在河南天冠实现了木薯燃料乙醇的固定化连续发酵，经过各种发酵条件的优化，在初糖浓度250g/L的情况下，乙醇浓度可以达到108.14g/L，生产力达到14.71g/L/h，乙醇产率可以达到48%左右。同时，连续生产20批次，总时间达到360h以上，未发现有明显的发酵性能下降，可以实现工业化生产。