固定化真菌-细菌共生体系对冻融环境的抗性机制及其对土壤多环芳烃的降解性能研究

Soil freezing and thawing processes affect soil microorganisms significantly, how to solve this problem is an important scientific issue for the effective application of microbial technique in remediation of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in Northern cold region. This project aims to setup an immobilized polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading fungi-bacteria system with resistance ability to freezing and thawing. Selection of PAH degrading strains with resistance ability to freezing and thawing and immobilization carrier materials will be conducted. Optimization of system configuration, selection of species and ratios of fungi to bacteria of the PAH degrading strain system, and study of affecting factors will be conducted to obtain optimized parameters for the immobilized degrading fungi-bacteria system. PAH contaminants in freeze and non-freeze soils will be removed through the immobilized system, and effects of several environmental factors on PAH removal efficiencies will be assessed, and dynamic model for the degradation of PAHs by joint fungi-bacteria system will be analyzed and setup. Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) method，confocal laser scanning microscope (CLAM)，scanning electron microscopy (SEM) and FT-IR Spectromete technology will be used to analyze the physiological and ecological characteristics of the strain system and morphological characteristics of the carrier. This project can demonstrate PAH biodegradation characteristics from soil and resistance mechanism of the immobilized fungi-bacteria symbiotic system to freezing and thawing processes, and provide theoretical basis for the remediation of PAH contaminated soil in Northern cold region.

在北方寒冷地区大规模推广和应用微生物原位修复技术时，如何克服土壤冻融环境对PAHs降解菌造成的冲击是所要解决的关键科学问题。本项目以固定化噬低温真菌-细菌共生体系构建为重点，通过对噬低温PAHs优势降解菌群筛选、真菌与细菌生物量比例和种类优配、固定化载体材料选择、构建条件优化及影响因素的研究，确定固定化噬低温真菌-细菌共生体系构建的最佳参数。利用该固定化体系去除冻融土壤PAHs污染物，考察多种环境因素对去除效果的影响，分析和建立噬低温真菌-细菌联合降解过程本征动力学模型。利用PCR-DGGE、激光扫描共聚焦显微镜（CLAM）、扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶红外光谱（FTIR），分析混合菌自身生理生态特性与载体微环境表征，进而揭示固定化真菌-细菌共生体系对冻融环境的抗性机制及其对土壤PAHs的降解性能。本研究成果可为北方寒冷地区PAHs污染土壤微生物原位修复提供理论借鉴。

本项目利用冻融土壤中真菌与细菌降解PAHs协同作用，设计对冻融过程具有抗性的耐低温真菌-细菌共生体系，并将其固定在植物残体上，用以去除土壤中PAHs污染物，促进寒冷地区微生物修复PAHs进程。主要结论如下：（1）筛选出了对冻融环境具有抗性的PAHs降解真菌-细菌最优组配，从降解率、降解速率、动力学方程3个指标来看，混合菌S4J7最优，60 d后可降解37.15%的Pyr和27.41%的BaP，经鉴定S4为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，J7为高山被孢霉(Mortierella alpina sp.)。（2）设计了真菌-细菌共生体系固定化路线，优化了固定化工艺，并考察了多种环境因素对PAHs去除效果的影响。玉米芯（Y）为最佳载体，Y-S4J7对PAHs的最佳降解温度为10℃，含水量为最大田间持水量的20%~60%时，降解效果更好；当PAHs初始浓度为30 mg·kg-1，接种量为10%~15%时，Y-S4J7降解效果最好。（3）模拟了自然土壤环境，阐明了自然环境和生物因素对固定化真菌-细菌共生体系PAHs 降解性能的影响。在土著菌存在的情况下，经固定化混合菌处理60 d后，Phe、Pyr、BaP的残余率分别为41.51%，54.09%和62.93%。 （4）利用高通量测序技术探明了固定化混合菌对土壤中PAHs降解过程与体系中真菌-细菌群落结构变化的相关性。投加固定化真菌-细菌共生体系后，细菌的Shannon多样性指数下降至2.33，真菌的Shannon多样性指数增加至1.01，PAHs的降解和细菌微生物多样性呈负相关，属水平下Pseudomouas sp.和Mortierella alpina.在低温下仍能良好的生长代谢，并成为降解过程的优势菌株。固定化混合菌的投加提高了PAHs生物有效性，改变了土壤中微生物群落的结构和丰富度，提高了低温土壤PAHs的原位修复效果。（5）通过SEM扫描电镜观察,玉米芯载体上的菌丝繁密，细菌随菌丝的生长而移动，可充分发挥细菌-真菌协同作用，对PAHs的降解表现出了较大的优势，载体材料来源广泛，无毒，可生物降解，有利于微生物的生长，可促进PAHs污染土壤的修复。本研究证实了利用耐低温固定化真菌-细菌共生体系修复PAHs污染土壤的可行性，为微生物技术修复北方寒冷地区受PAHs污染的冻融土壤的大规模推广和应用提供理论与实践借鉴。