多胺及转运体基因在牛筋草对百草枯抗性中的功能验证

This project will establish goosegrass (Eleusine indica L.) genetic transformation system mediated by Agrobacterium tumefaciens, with optimizing the culture condition of the goosegrass tissue culture and regeneration system with paraquat-susceptible goosegrass used as explants, and selecting the condition of Agrobacterium infected goosegrass callus. It will be a good base to research the hereditary character of goosegrass such as herbicide resistant. The polyamines and transporter genes will be cloned using paraquat-resistant goosegrass as template. Through constructing over and antisense expreseeion vector, the genes will be transferred into goosegrass by Agrobacterium to process its functional verification finally. The project will have important significance to elucidate the resistance mechanism of paraquat, provide reference to scientific paraquat application, and promoting the study of herbicide transgenic organism.

本项目以百草枯敏感型牛筋草为外植体，优化牛筋草组培再生体系培养条件，筛选农杆菌侵染牛筋草愈伤组织的条件，建立利用农杆菌介导获得转基因牛筋草植株的遗传转化体系，为牛筋草抗药性基因等遗传特性的研究打下良好基础；以百草枯抗性型牛筋草为模板，克隆百草枯抗性相关的多胺及转运体基因，通过构建正反义表达载体，遗传转化获得转基因牛筋草，鉴定该基因对百草枯的抗性作用。本项目对阐明百草枯抗性机理有重要意义，为科学施药、延长百草枯的使用寿命提供参考依据，同时为除草剂抗药性转基因研究提供理论基础。

通过对广东省农田牛筋草抗性的监测，筛选出MZ04种群对百草枯抗药性水平最低，QY05种群是MZ04的12.94倍。在百草枯处理下牛筋草内源多胺含量增加，而经亚精胺预处理后，SOD和POD活性逐渐降低，说明亚精胺可能参与百草枯的抗性。.基本培养基为MS和N6培养基，其中液体培养基中无琼脂和凝胶，在培养基温度降至45℃左右加入抗生素。该再生体系具有生根量大，出苗时间短，从幼苗到植株时间在1个半月。.以抗性生物型和敏感生物型牛筋草种子为外植体诱导愈伤组织，通过对潮霉素浓度、羧苄青霉素浓度、菌液浓度、侵染方式、侵染时间、乙酰丁香酮和共培养时间条件的筛选，初步建立了农杆菌介导的牛筋草遗传转化体系。.克隆出4个候选基因全长， PCR扩增PqE插入在SpeI与BamHI两个酶切位点之间1563 bp，保存于宿主大肠杆菌top10；PqTS1插入在KpnI与BamHI两个酶切位点之间939 bp，保存于宿主大肠杆菌top8；分别RT-PCR扩增大片段基因PqTS2基因CDS区3800 bp(片段两侧添加KpnI酶切位点)、PqTS3基因CDS区3066 bp（片段两侧添加BamH I/Spe I酶切位点），保存于宿主大肠杆菌HST08。.检测出转基因材料77株，转基因植株占54.23%，转自PqE基因的水稻有41株，其中T0代20株、T1代21株，转PqTS1基因水稻有T0代15株，转PqTS3基因水稻有21株，其中T0代有7株、T1代为14株。.通过施用1 mmol•L-1 Spd处理可以促进百草枯胁迫下敏感生物型牛筋草幼苗的生长发育，提高叶片的光合能力，增强渗透调节能力，增加抗氧化系统的保护能力。可见，Spd预处理能够在一定程度上缓解百草枯对敏感生物型牛筋草的防控效果。