牛筋草对PSⅡ、EPSPS和GS抑制剂的多抗性及蛋白质组学研究

Goosegrass is a malignant weed in agricultural production. The frequent occurrence of resistant goosegrass populations, especially the multi-resistance populations, poses a serious threat to crop production caused by herbicide abuse. Therefore, elucidating the mechanism of multi-resistance is vital to control resistant weeds. The study uses biological assary ways and rapid molecular method for target site to detect the resistant levels of goosegrass populations from 13 different places .Comparative analysisof resistant and multi-resistant goosegrass populations (R/S) in response to PSII, EPSPS and GS and which could be acquired as the main research objects; By comparing and analyzing the physical and biochemical, this paper clarifies a relationship between metabolic enzymes and resistance and multiple-resistance; By comparison and analysis of differential proteins and target proteins, Proteome and epigenetics are combined to identify candidate resistance genes and related proteins. By selection of target genes and proteins in usage of Western blot, herbicide resistant transgenic plants is used to conversely verify the function of the key multi-resistant genes with related to the multi-resistant proteins of PSII, EPSPS and GS, which exsited in the multi-resistant goosegrass population, in order to illuminate analysis and function of multi-resistant protein. Finally, it is epigenetic omics, protein group and genome level clarify the molecular mechanism of multi-resistance to these three inhibitors that provides theoretical basis for studying the mechanism and control of weed resistance.

牛筋草是农业生产中重要恶性杂草，除草剂的大量应用导致抗性牛筋草种群频繁发生，甚至多抗性种群出现，严重威胁作物生产，阐明它们抗性的机理有利于治理抗性杂草。本项目利用生物测定法和靶标抗性分子法检测来自13个不同地方的牛筋草种群抗药性水平，比较分析获得对PSⅡ、EPSPS和GS抑制剂的抗性及多抗性牛筋草种群（R/S）作为主要研究对象；利用生理生化差异分析，明确牛筋草生理生化代谢酶与抗性及多抗性的关系；利用差异蛋白与目标表达蛋白比较分析，结合蛋白组和表观遗传组学等方法鉴定候选抗性基因及相关蛋白质；利用蛋白质印迹法最终选定目标基因和蛋白，以及利用抗除草剂转基因植物反向验证牛筋草对PSⅡ、EPSPS和GS抑制剂等产生多抗性的关键抗性基因及相关特异蛋白的作用，获得多抗性蛋白与其功能分析；从表观遗传组学、蛋白组与基因组水平阐述对此三种抑制剂的抗性及多抗性分子机制，为揭示杂草抗性机理和治理提供理论依据。

本课题组分别于2019年和2021年采集广东省不同地区牛筋草种群，测定其对草铵膦、百草枯和草甘膦抗性水平的变化，结果表明8个牛筋草种群对草铵膦的抗性均有提高，且ST01及MZ02两个种群对百草枯、草甘膦与草铵膦产生了多抗性，并筛选了能够有效防除抗性杂草的除草剂复配组合。以草铵膦抗性种群AUS和CS02及敏感型种群NX为试验材料，喷施7 g a.i.ha-1草铵膦（敏感生物型半致死剂量）后，结果表明，喷施草铵膦后不同种群牛筋草中的GOGAT、GDH和GS酶活性均显著下降，而AUS牛筋草植株中的GS酶活性显著高于其他种群，转录组测序分析筛选到了与草铵膦抗性相关的GS基因4个、GDH基因1个，CA基因1个，NirA基因1个，因此牛筋草对草铵膦的抗性与其标靶基因GS密切相关，且与非靶标机理如铵代谢亦有关。本课题组前期研究表明牛筋草β-酮酰基辅酶A合酶基因（EiKCS）在抗性生物型牛筋草中转录水平较高，因此通过同源克隆将其构建超表达载体，分别转化了牛筋草和水稻，获得了超表达EiKCS转基因牛筋草和水稻株系。剂量效应表明超表达EiKCS显著提高牛筋草和水稻对百草枯的抗性。百草枯处理超表达EiKCS水稻，结果表明百草枯处理显著降低KCSox水稻中总蛋白质含量，显著提高水稻叶片中的叶绿素荧光参数值、SOD、POD和CAT的酶活性。转录组学和蛋白组学联合分析表明在超表达EiKCS转基因牛筋草中，KCS基因调控参与多胺生物合成途径的蛋白质（EiQ6ZG77和EiQ9SMB1）相互作用，并特异性启动根系蛋白EiPIP2-4与多胺有关来应对百草枯的胁迫。在超表达EiKCS转基因（KCSox）水稻中，HPLC-MS/MS表明KCSox水稻显著提高其精胺的含量，而蛋白组学表明KCSox水稻的多胺合成途径中，精氨酸脱羧酶（ADC）途径促进了水稻腐胺的合成；Q9SMB1（亚精胺合成酶I）促进了腐胺向亚精胺的单向转化，然后亚精胺向精胺的转化，以应对百草枯胁迫。通过比较过量表达EiKCS牛筋草和草胺膦抗性牛筋草蛋白组，结果表明进一步过表达EiKCS转基因牛筋草主要通过调控的多胺合成及根系EiPIP2-4蛋白来提高其对百草枯的抗性。