豆源抗氧化肽基于细胞模型抗氧化调控作用机理及信号传导

抗氧化剂对有机体由于氧化应激所导致的失调及疾病的作用效果及机理研究已经成为食品、医药、化妆品等领域研究的热点课题。作为天然抗氧化剂来源之一的抗氧化肽的筛选、体外抗氧化效果评价研究已经成为相关领域科学家研究的焦点。然而，建立体外抗氧化活性与体内作用机理的关系研究将成为未来抗氧化肽研究与应用的重中之重。本课题将选取植物蛋白源大豆、鹰嘴豆及蚕豆抗氧化肽为研究对象，运用体外细胞模型从分子水平研究豆源抗氧化肽的抗氧化活性及其作用调控机理。利用动物及人小肠上皮细胞线Caco-2和HT-29在H2O2刺激下，探讨抗氧化肽对细胞内各种抗氧化非酶及酶类物质、细胞因子IL-8及其基因表达调控作用，揭示豆源抗氧化肽的细胞内抗氧化调控作用机理；通过研究胞内钙离子流、跨膜电位变化及抗氧化肽的信号响应因子与调控转录因子Nrf2及NF-KB、AP-1的相互作用关系，阐明抗氧化肽的作用信号传导通路。

本项目申请主要研究鹰嘴豆源抗氧化肽的抗氧化作用及其机理。主要实验结果如下：.首先，考察鹰嘴豆生物活性肽对自由基的清除能力。随着活性肽浓度的增大，清除DPPH•和O2—•的能力逐渐增强。活性肽浓度为10 mg/mL时DPPH•清除率可达79.2%，O2—•抑制率达到60.0%。实验结果表明鹰嘴豆生物活性肽有较好的抗氧化能力。.其次，用不同浓度鹰嘴豆生物活性肽处理细胞后，继而用H2O2作用。测定细胞内的过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GSH-Rx）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力和丙二醛（MDA）含量的变化。在Caco-2细胞中，与阳性对照组相比，当鹰嘴豆生物活性肽浓度为0.5 mg/mL时，CAT酶活力、GSH-Rx酶活力和GSH-Px酶活力分别提高了40.2%、54.0%和101.5%；HT-29细胞中，与阳性对照组相比，浓度为0.5 mg/mL的鹰嘴豆生物活性肽处理后的细胞内CAT酶活力、GSH-Rx活力和GSH-Px酶活力分别提高了33.2%、31.0%和102.0%。表明鹰嘴豆生物活性肽对H2O2诱导的氧化损伤细胞有保护作用。.再次，采用RT-PCR的方法对Nrf2及其调控的下游抗氧化酶基因（血红素氧合酶HO-1、谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS和醌氧化还原酶NQO1）的mRNA的表达量进行测定。实验结果表明，与阳性对照组相比，经鹰嘴豆生物活性肽处理的Caco-2细胞中的Nrf2、HO-1、γ-GCS和NQO1的mRNA的表达量分别增加了3.1、3.0、3.4和3.5倍；HT-29细胞中的Nrf2、HO-1、γ-GCS和NQO1的mRNA的表达量分别增加了2.9、3.0、3.6和3.2倍。实验结果表明活性肽处理后的细胞Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS的mRNA表达量均有显著性升高，活性肽对Caco-2细胞和HT-29细胞有保护作用。.最后，采用Western Blot对Nrf2及其调控的下游抗氧化酶(HO-1、γ-GCS、NQO1以及GAPDH)的蛋白表达量进行测定。结果表明，随着鹰嘴豆生物活性肽浓度的增大，Caco-2细胞和HT-29细胞内的Nrf2和抗氧化酶的蛋白表达量呈现增大的趋势。通过mRNA和蛋白表达量的变化发现鹰嘴豆生物活性肽能够激活Nrf2-Keap1信号通路，引起Nrf2从Keap1上解离，促使下游目的基因的转录和表达。