LIPUS调节巨噬细胞分泌LRP1影响BMSCs分化介导腱骨界面损伤修复的机制研究

Low intensity pulsed ultrasound stimulation (LIPUS) was able to enhance the tendon bone interface healing via promoting the regeneration of new bone and fibrocartilage, but the mechanism is unclear. We found that macrophage play a important role in the LIPUS treatment on tendon bone healing. After stimulated by LIPUS, the culture supernatants of macrophage was able to regulate the lineage fate of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) between osteoblasts and fibrocartilages. We identified a key factor: Low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1). Therefore, we hypothesize that “LIPUS enhance the tendon bone healing through promoting the macrophage secretion of LRP1 to regulate the differentiation of BMSCs, by activating p38MAPK/β-Catenin pathway”. To test this hypothesis, firstly, we will determine whether acceleration of LIPUS can be blocked when eliminate the macrophage using clodronate liposomes, in a mice rotator cuff injury model. Secondly, after simulated by LIPUS, the regulation of macrophage on BMSCs lineage fate will be tested in vivo and in vitro. At last, we will validate the effect of LRP1, secreted by macrophage, on the osteogenic and chondrogenesis differentiation of BMSCs via activating the p38MAPK/β-Catenin pathway. This project will complete the regulation mechanisms of LIPUS on the therapy of tendon bone interface injury and provide a theoretical basis for the clinical application of LIPUS in the treatment of tendon bone injuries.

低强度脉冲超声（LIPUS）可促进腱骨界面新生骨与纤维软骨再生，加速损伤修复，但其机制不明。我们前期发现这可能与巨噬细胞介导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化有关，且在LIPUS刺激后的巨噬细胞上清液中筛选出可能关键因子，即低密度脂蛋白相关受体蛋白1（LRP1）。基于此，本课题提出“LIPUS通过调节巨噬细胞分泌LRP1，激活p38MAPK/β-Catenin通路影响BMSCs成骨与成软骨分化，促进腱骨界面损伤修复”的假说。为了验证此假说，建立小鼠肩袖损伤模型，明确巨噬细胞及LRP1在LIPUS促进腱骨界面损伤修复中的作用；并利用干细胞体内示踪和体外实验，证实该作用效应与影响BMSCs的成骨成软骨分化有关；进一步体外探究巨噬细胞分泌的LRP1激活p38MAPK/β-Catenin通路是其重要的分子机制。本研究将通过揭示LIPUS促进腱骨界面损伤修复机制，为优化其临床治疗方案提供理论基础。

低强度脉冲超声（LIPUS）可促进腱骨界面新生骨与纤维软骨的再生，加速愈合，但其机制不明。我们前期研究发现：LIPUS治疗腱骨界面损伤与巨噬细胞相关；其刺激后巨噬细胞会影响骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨及成软骨分化，并筛选出可能关键因子：低密度脂蛋白相关受体蛋白1（LRP1）。通过本课题的开展，发现利用氯膦酸二钠脂质体清除小鼠体内巨噬细胞后，小鼠肩袖腱骨界面的生物力学特征（包括拉断负荷和拉断刚度）显著降低，在术后4周时新生的腱骨界面纤维软骨层以及腱骨界面骨质均变差，并且LIPUS对腱骨界面愈合的促进作用显著降低，说明LIPUS可能通过巨噬细胞发挥着促进腱骨界面愈合的作用；此外，在腱骨界面愈合过程中还发现LIPUS能够促进肩袖愈合界面的巨噬细胞向M2型转变。至于关键因子LRP1，通过qPCR和ELISA检测发现LIPUS治疗能够提高巨噬细胞分泌的LRP1水平，大概提高8.7倍，利用慢病毒干预降低巨噬细胞分泌的LRP1水平后，小鼠腱骨界面损伤修复质量同样降低，说明巨噬细胞及其分泌的LRP1在LIPUS促进腱骨界面愈合中发挥着重要的作用。结合体外细胞学实验，发现LIPUS刺激能够有效提高巨噬细胞分泌的LRP1水平，利用慢病毒干预降低LRP1水平后，巨噬细胞分泌的LRP1水平降低。利用上清液干预BMSCs后，高水平的LRP1（LIPUS组）能够促进BMSCs成骨和成软骨分化，并且p-p38水平和β-catenin随着LRP1水平发生的响应的变化。.本课题顺利完成，目前已经以第一标注发表专业SCI论文4篇，中文CSCD论文2篇，协助培养博士研究生1名，硕士研究生1名，超额完成了实验预期的研究目标。