PRRSV对猪肺微血管内皮细胞功能的影响及对其调控性中药成分的筛选

Microvascular endothelial cells (MVECs) possess extensive biological functions and were documented to play important roles in infection of many viruses. Clinical symptoms and pathological changes induced by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) suggest their close correlation with microvascular endothelial dysfunction. Our previous studies showed that numerous ingredients of traditional Chinese herbs can regulate various functions of MVECs, and it is speculated that some ingredients would play potential roles in anti-PRRSV induced injuries of MVECs. In this project, porcine lung MVECs will be cultured in vitro, and their susceptibility to PRRSV will be detected. Gene microarray and lectin microarray will be used to explore effects of PRRSV on gene and carbohydrate expression in PRRSV-treated porcine lung MVECs, and the main functional factors will be verified in lung tissues of artificially infected pigs by immunohistochemistry and lectin histochemistry. Ingredients of traditional Chinese herbs will be screened against injuries of MVECs induced by PRRSV treatment. Thus, effects of PRRSV on functions of porcine lung MVECs are uncovered, and the mechanism of anti-PRRSV injuries of traditional Chinese herbal ingredients is discovered. The expected results will demonstrate the pivotal roles of MVECs in PRRSV infections, have important significance in elucidating pathological mechanisms of PRRSV, and lay a foundation for developing traditional Chinese herbal ingredients of anti-PRRSV injuries.

微血管内皮细胞（MVECs）生物学功能广泛，已被证明在多种病毒感染中起重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染猪的临床症状和组织病变等均提示与MVECs功能障碍密切相关。课题组前期研究表明诸多中药成分可调控MVECs多种功能，提示某些中药成分有抗PRRSV损伤MVECs的潜在作用。本项目拟体外培养猪肺MVECs，检测其对PRRSV的易感性，采用基因芯片和凝集素芯片技术探索PRRSV对猪肺MVECs功能基因和糖分子表达的影响，进一步利用免疫组化和凝集素组化技术确证变化的主要功能分子在人工感染PRRSV猪肺组织的表达，并筛选抗PRRSV损伤猪肺MVECs的中药成分，以揭示PRRSV对猪肺MVECs功能的影响，探索中药成分抗PRRSV损伤的机制。项目预期结果将证明MVECs在PRRSV感染中的关键作用，对阐明PRRSV的致病机制有重要意义，为开发抗PRRSV损伤的中药成分奠定基础。

仔猪肺脏炎性损伤是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染所致的主要病理变化之一，微血管内皮细胞（MVECs）在炎症反应等诸多生理过程和病理变化中具有关键作用，而其在PRRSV感染中的作用和地位鲜见研究报道。本项目以体外培养猪肺MVECs为模型，研究了PRRSV对其感染性，及对其转录组、蛋白质表达谱和糖表达谱的影响，并筛选了对其部分重要功能分子有显著调控作用的中药成分，完成了主要研究内容，达到了拟定研究目标。结果显示，PRRSV感染24h时细胞内即可检测到病毒蛋白，感染72h后细胞病毒蛋白呈显著性增加，感染4-5天后出现明显CPE，感染细胞可释放具有感染力的病毒；PRRSV感染猪肺MVECs 36h时，转录组测序分析检测到228个差异表达基因，其中139个上调、89个下调，差异表达基因的分子功能涉及结合、催化活性、信号传感活性、趋化活性等，包括IL-1、IL-6、CXCL2、CXCL8、CXCL10、VCAM-1、TNFAIP3、TLR4和NFKBIA等大量与炎症反应和免疫调节相关的基因；PRRSV感染猪肺MVECs 48h时，TMT定量蛋白质组测序分析检测到558个差异表达蛋白分子，其中上调336个、下调222个，涉及生物调节、对刺激的反应、信号传递、免疫系统等生物学过程，包括CAV-1、IFIT-3、HSP-60、MHCII类分子等与抗原处理与呈递、炎症反应相关的分子；PRRSV感染猪肺48h时，凝集素芯片分析检测到LCA、DSA和PHA-E荧光信号的减弱，及RCA-I、LEL和STL荧光信号的增强；黄芪多糖、黄芩苷和甘草次酸等多种中药成分，对PRRSV诱导的猪肺MVECs基因和蛋白分子差异表达，及糖链含量变化有显著性调控作用，而对感染猪肺MVECs内PRRSV增殖无抑制作用。本项目研究表明，猪肺MVECs对PRRSV具有易感性，PRRSV感染诱导猪肺MVECs炎症反应和免疫调控相关功能分子的广泛变化，黄芪多糖等中药成分则能调控PRRSV感染所致猪肺MVECs的功能改变。本项目率先提出并证实了猪肺MVECs在PRRSV感染中具有重要作用，提出通过调控MVECs功能抗PRRSV感染的思路，筛选了多种能显著抗PRRSV感染致猪肺MVECs功能变化的中药成分，研究结果对全面揭示PRRSV的致病机制和开发防治该病毒病的中兽药产品具有重要意义。