基于Nrf2/ARE信号通路的蛋清源小肽协同抗氧化作用机制研究

Synergistic antioxidant effect of egg white small peptides refers to the presence of synergies between different small peptides with a stronger antioxidant activity than individual small peptides. Egg white antioxidant peptides have been widely studied and used. However, given the current length of general antioxidant peptides is more than three amino acids, which cannot easily be absorbed intact, it is difficult to truly play an role of antioxidant in vivo. Besides, the overall number of the small peptides that may be completely absorbed is so limited that its antioxidant activity is not commonly concerned. Thus the study of small peptides synergistic antioxidant effect is important in egg processing industry. Based on the synergistic antioxidant effect of small peptides via Nrf2/ARE signaling pathway, this project starts from egg white small peptides, to study the egg white small peptides and their synergistic effect on nuclear transcription factor Nrf2 and its downstream antioxidant protein levels. The egg white small peptides' anti-oxidation inhibition for Nrf2-Keap1 is conducted with fluorescence polarization assays, and the molecular simulation of the inhibiting effects is processed using molecular docking method, to reveal the molecular mechanisms of anti-oxidation for the egg white small peptides and their synergistic effect via Nrf2/ARE signaling pathway. The relational model between small peptides' structure and synergistic antioxidant activity is constructed using amino acid descriptors, to clear the QSAR of egg white antioxidant small peptides via Nrf2/ARE signaling pathway. Through the research of this project, it will provide convincing evidences on molecular level for the Nrf2-based synergistic antioxidant egg white small peptides, and contribute to the research and application of egg white antioxidant small peptides.

蛋清源小肽的协同抗氧化作用是指不同小肽之间因存在协同作用而比单独小肽具有更强的抗氧化活性。鉴于蛋清源抗氧化肽虽被广泛研究和应用，但一般抗氧化肽长度大于3个氨基酸，不易被完整吸收，难以真正在体内发挥作用，而可被完整吸收的小肽总体数量有限，其活性亦不被普遍关注，因此研究蛋清源小肽的协同抗氧化作用对蛋品加工有重要意义。本项目从蛋清源小肽着手，基于核转录因子（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路研究小肽的协同抗氧化作用，明确蛋清源小肽协同抗氧化作用对Nrf2及其下游抗氧化蛋白的影响，并通过研究蛋清源小肽协同抗氧化作用对Nrf2-Keap1的抑制作用和分子模拟，揭示蛋清源小肽基于Nrf2/ARE信号通路的协同抗氧化分子机制，明确蛋清源小肽的结构与协同抗氧化作用之间关系。通过本项目研究，可在分子水平上为蛋清源小肽的协同抗氧化作用提供佐证，为蛋清源协同抗氧化小肽的科学研究和加工应用奠定理论基础。

本项目主要针对小肽协同抗氧化及其作用机制进行研究，主要研究内容和结果如下:(1)在所研究的36条二肽中，含有半胱氨酸的二肽具有较好的单独及协同抗氧化作用，不含半胱氨酸的二肽抗氧化活性不明显,即二肽的单独和协同抗氧化作用效果与组成它的氨基酸关系密切；（2）三肽CNR和CEH均具有较好的单独及协同抗氧化作用，且三肽CNR和CEH对HepG2细胞无毒性作用，对细胞的凋亡具有保护作用，同时，添加三肽CNR及CEH后细胞内的ROS含量受到抑制，MDA水平显著下降，抗氧化酶活性均有所提高，且这些作用均具有有较强的剂量依赖效应；（3）五肽WNWAD的拆分片段WN与WAD的协同作用具有比WNWAD更强的抗氧化作用，与氧化损伤组相比，WN和WAD的协同使用能提高SOD，GSH-Px，CAT的活性，并且降低MDA和LDH的水平；（4）通过分子对接方法建立并优化了由8400条小肽组成的蛋清源扩展小肽库，并针对Keap1晶体分子设计了三个新的结合位点：位点1（中心坐标为x:-4，y:6，z:0，半径21Å），位点2（中心坐标为x:5，y:9，z:1，半径15Å）和位点3（中心坐标为x:7.36，y:8.33，z:1.77，半径15Å）最终筛选出了抑制Keap1-Nrf2相互作用能力最强的20条小肽，最后通过荧光偏振法筛选得到了抗氧化活性较强的小肽DKK与DDW，而小肽DKK与DDW进入到H2O2损伤过的HepG2细胞质中，占据了Nrf2与Keap1的结合位点，导致细胞质中的Nrf2转移到细胞核中，与Maf形成异源二聚体后，结合ARE，促使ARE所调控的CAT和SOD基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升；（5）同时，我们也发现玉米源小肽混合物具有较强的细胞内协同抗氧化作用，玉米混合小肽对H2O2氧化损伤HepG2细胞内抗氧化酶SOD、CAT和GR活性和总GSH水平具有提升作用，而对正常组相应抗氧化酶和GSH的调节作用不显著，说明玉米抗氧化肽对细胞内抗氧化酶和GSH的协同调节作用涉及的信号通路可能只在细胞发生氧化应激时才会被启动。