FGFR4/CMC-HPLC/MS筛选白芥子促肿瘤细胞凋亡活性成分研究

It is a hotspot for tumor treatment research to looking for safe and effective anti-tumor components from traditional Chinese herbal medicine using receptor-based parmaceutical screening techology. Trysoine kinase receptor have been proved to be an excellent drug screening target for cancer therapy. Inhibiton of fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) can promot cancer cell apoptosis and sensitive chemo-drug. In present study, we firstly establish overexpressing HEK293-FGFR4 cells by stabilized transfection method. Based on techniques of pharmaceutical analysis and cell membrane chromatography, HEK293-FGFR4 cells are applied in FGFR4/CMC-HPLC/MS model to screening and identify active components from Sinapi alba L. Then, we could elucidate the effect and mechanism of screened active components on cancer cell apoptosis and increasing drug sensitivity via in vitro experiment MTT, cell cycle, apoptosis analysis, QT-PCR, western blot. The research can biuld a new model for screening natural anti-tumor components. we can also elucidate that FGFR4 is the drug screening target for chemosensitivity. This study is benficial to extending our mind on screening anti-tumor drug.

利用以受体靶标为核心的药物直接筛选技术，从药用植物中寻找高效、低毒抗肿瘤活性成分是药物研究的热点内容之一。抑制酪氨酸激酶受体家族成员FGFR4在癌细胞中的表达可促进肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤细胞药物敏感性。本项目在前期工作的基础上，利用细胞生物学、色谱科学、药物分析等技术，以FGFR4为研究对象，构建HEK293-FGFR4高表达细胞系，建立高表达FGFR4/CMC-HPLC/MS筛选模型，筛选、鉴定中药白芥子中可与FGFR4相互作用的活性成分；通过MTT、cell cycle、apoptosis analysis、放射性标记化合物标记分析、QT-PCR、western blot等方法，分析活性成分促肿瘤细胞凋亡的作用及分子机制，并验证其抗肿瘤活性。本项目不仅为阐明FGFR4作为抗肿瘤增敏药物筛选靶标提供实验依据，同时为筛选抗肿瘤天然活性成分提供新的研究模型，为抗肿瘤药物筛选开拓思路。

本项目利用FGFR4受体靶标为研究对象，建立细胞膜色谱的药物直接筛选技术，从药用植物中寻找高效、低毒抗肿瘤活性成分是药物研究的热点内容之一。抑制酪氨酸激酶受体家族成员FGFR4在肿瘤细胞中的表达可促进肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性。.1. 以FGFR4为研究对象，构建HEK293-FGFR4 高表达细胞株，并以此建立高表达FGFR4/CMC模型，从白芥子提取物中筛选活性组分，通过搭建的在线二维联用HPLC/MS 筛选系统，从白芥子中筛选、鉴定可与FGFR4 相互作用的活性成分为芥子碱，并初步验证其对HEK293-FGFR4细胞株活性，发现芥子碱可有效抑制HEK293-FGFR4 细胞增殖。.2. 课题按照计划要求开展药物增敏研究，芥子碱单独给药表现出较低的细胞毒性，对Caco-2细胞杀伤性小，而多柔比星给药同样表现出较低细胞毒，将芥子碱联合多柔比星给药，发现Caco-2细胞凋亡率增加，高于芥子碱和多柔比星单独给药后的凋亡率，因此，认为芥子碱逆转Caco-2细胞耐药活性，增加化疗药物多柔比星促细胞凋亡率。通过流式细胞术研究发现，芥子碱可以提高多柔比星胞内浓度，具有增敏效果。通过免疫印迹分析发现，芥子碱造成p-gp蛋白表达量降低，但对g-pg基因转录水平影响不大，因此，推测芥子碱在转录后水平调控p-gp蛋白表达。.3. FGFR4存在突变型Y365C-FGFR4，该突变型导致FGFR4持续磷酸化。通过点突变实验，对FGFR4编码区365进行突变，构建Y367C-FGFR4-pEGFP-N1，转染、稳定筛选得到Y365C-FGFR4高表达细胞，发现Y365C-FGFR4高表达细胞增殖性较阴性细胞强。.4. 建立Y367C-FGFR4细胞膜色谱模型，进行CMC-HPLC/MS在线分析系统筛选，发现川芎提取物中的活性成分为欧当归内酯A，MTT发现欧当归内酯A可以抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞增殖，降低FGFR4介导的通路磷酸化，具有逆转抗肿瘤药物敏感性。.本项目不仅为阐明FGFR4 作为抗肿瘤增敏药物筛选靶标提供实验依据，同时为筛选抗肿瘤天然活性成分提供新的研究模型，为抗肿瘤药物筛选开拓思路。