NGT介导的非wzy依赖途径细菌多糖蛋白质缀合物疫苗生产

Glycoconjugate vaccine provides an attractive approach for fighting the infectious diseases. The traditional approach suffers from multiple fermentations, purification steps, low yields, and therefore, leading to the high cost of vaccine production. The objective of this proposal is to explore bacterial protein glycosylation systems to obtain polysaccharide conjugate vaccines in an efficient, and easily applicable way.There are three mechanisms of bacteria polysaccharides synthesis: wzy dependent pathway, ABC transporter dependent pathway and synthase-dependent pathway. The production of glycoconjugates of non-wzy dependent pathways remains to be resolved. Based on the similarity of non-wzy-dependent pathway and bacteria protein N-glycosylation pathways, these two pathways were coupled to synthesize non-wzy-dependent polysaccharide protein conjugate vaccines. NGT is used to produce bacterial glycoconjugates of non-wzy- dependent pathways.

化学法生产多糖蛋白缀合物疫苗具有诸多不足。生物法可避免现有缺点。细菌表面多糖的合成机制有三种：wzy依赖，ABC转运器依赖和合酶依赖途径。目前利用PglB/PglL解决了wzy依赖细菌多糖蛋白缀合物的生物合成难题。其余两种非wzy依赖多糖蛋白缀合物的生物法合成仍有待解决。基于两种非wzy依赖细菌表面多糖合成过程与NGT介导蛋白质N-糖基化途径的相似性，我们设想将这两种非wzy依赖细菌多糖合成过程与NGT介导的蛋白糖基化过程偶联，用来合成非wzy依赖多糖蛋白缀合物疫苗。我们拟选用肺炎链球菌3型作为合酶依赖模式菌，E.coli O8作为ABC转运器依赖模式菌。在了解NGT酶学性质基础上，建立识别不同糖核苷酸的NGT酶库，进而建立一种新的多糖蛋白缀合疫苗生物合成方法。本项目不仅解决了非wzy依赖细菌多糖蛋白缀合物疫苗生物法合成难题，而且扩大了酶法合成糖蛋白缀合疫苗的应用范围。

化学法生产多糖蛋白缀合物疫苗具有诸多不足。生物法可避免现有化学法生产的缺点。基于两种非wzy依赖细菌表面多糖合成过程与NGT介导蛋白质N-糖基化途径的相似性，我们试图在了解NGT酶学性质基础上，建立识别不同糖核苷酸的NGT酶库，进而建立一种新的多糖蛋白缀合疫苗生物合成方法。目前我们已经获得不同来源NGT，并对其酶学性质的探究，包括最适温度，pH和金属离子对其活性的影响。选取了一些UDP糖衍生物，研究了其对糖基供体底物特异性，同时分析了各种NGT对肽底物的特异性，结果发现他们显示出不同的底物选择性。为了开发具有更高催化效率或者更宽泛底物识别的N-糖基转移酶，有利于建立新的多糖蛋白缀合疫苗生物生产平台。我们通过两种方法对最终对得到的500株突变体进行筛选，确定并构建17株突变体。最终得到催化效率更高、底物识别性更为宽泛的NGT突变体。获得的NGT突变体不仅有更高的肽底物适应性，同时具有更广泛的糖底物适应性。在了解NGT酶学性质基础上，我们已经建立识别不同糖核苷酸的NGT酶库，进而建立了一种新的多糖蛋白缀合疫苗生物合成方法。本项目不仅解决了非wzy依赖细菌多糖蛋白缀合物疫苗生物法合成难题，而且扩大了酶法合成糖蛋白缀合疫苗的应用范围。