TLR4、TLR5在E.coli LF82介导炎症性肠病发生中的作用机制研究

Inflammatory bowel disease (IBD) is an abnormal immune response in the gastrointestinal tract due to multi-factors, but the pathogenesis is still unclear. Studies have found that mice.lacking TLR5 (TLR5KO).are prone to developing.spontaneous.colitis, while .mice lacking.both. TLR4.and.TLR5 rescue.the.colitis. Transient colonization by adherent-invasive Escherichia coli (AIEC) during microbiota acquisition results in chronic colitis in TLR5KO mice. Chronic intestinal inflammation in TLR5-deficient mice challenged with AIEC correlated with microbiota components having higher levels of bioactive LPS and flagellin. We found that AIEC mediated IBD in mice may not through the NF-κB signaling pathway alone. Combined with the above results, we suppose that AIEC results in the composition change of host gut microbiota, with higher levels of LPS and flagellin, and TLR5 recognizes flagellin to activate the NF-κB signaling pathway, TLR4 recognizes LPS to activate MyD88 independence signaling pathway, which finally induce IBD. We aim to clarify the mechanisms of TLR4 and TLR5 in AIEC strain LF82 mediated IBD by functional experiments and molecular biology experiments in TLR4 and TLR5 knockout mice, in order to provide a new perspective for the pathogenesis of IBD.

IBD是一种多因素所致的胃肠道异常免疫反应，但发病机制尚不明确。研究发现，TLR5基因敲除（TLR5KO）小鼠有产生自发性结肠炎的倾向，TLR4和TLR5基因共同敲除的小鼠则不出现。黏附侵袭性大肠杆菌（AIEC）短暂定植于无菌的TLR5KO小鼠，可导致其出现慢性结肠炎，且肠道菌群中LPS和鞭毛蛋白水平升高。我们前期发现AIEC介导小鼠产生IBD可能存在NF-κB以外的信号通路。结合上述结果，我们假设在AIEC的始动作用下，宿主肠道菌群构成发生变化，LPS和鞭毛蛋白表达水平升高，进而TLR5通过识别鞭毛蛋白而激活NF-κB信号通路，TLR4则与LPS相识别、并通过MyD88非依赖性途径介导IBD的发生。本课题拟通过TLR4、TLR5基因敲除小鼠体内功能学及分子生物学实验，直接阐明TLR4、TLR5在AIEC菌株LF82介导IBD发生中的具体作用机制，从而为IBD的发病机制提供新视角。

研究背景及目的：TLR4、TLR5在黏附侵袭性大肠杆菌感染小鼠结肠过程中可能起重要作用，本项目拟对其作用及可能机制进行探讨。方法：选择野生型及TLR4、TLR5基因敲除的SPF级C57BL/6小鼠，进行相关体内及体外功能学实验，探索感染E.coli LF82对DSS诱导的TLR4KO、TLR5KO、TLR4/5KO实验性结肠炎小鼠的作用，并通过检测E.coli LF82感染后实验小鼠血清中的相关下游分子表达水平，探讨TLR4、TLR5在E.coli LF82介导的炎症性肠病发生中的具体作用机制。结果：（1）E.coli LF82可破坏体外肠屏障细胞模型完整性、通透性；（2）E.coli LF82可在C57BL/6小鼠结肠肠道有效定植，并可诱发及加重小鼠结肠炎症；（3）E.coli LF82可加重TLR5KO DSS造模后小鼠结肠炎症，分别表现在DAI评分、结肠大体形态损伤、组织病理学及髓过氧化物酶活性等方面。且TLR5KO小鼠结肠组织磷酸化P38表达升高，但是升高的程度比野生型小鼠要低，磷酸化NF-κB P65的表达则变化不明显，表明除了通过TLR5激活的MAPK、NF-κB通路以外，E.coli LF82还可能通过其他方式或机制破坏上皮完整，并加重DSS小鼠结肠炎症；（4）经E.coli LF82及DSS处理后，TLR4KO小鼠肠道紧密连接蛋白表达有所增加，TLR4KO小鼠下游TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达明显降低，提示TLR4在该炎症反应通路中可能起重要作用；（5）经E.coli LF82 及DSS处理后，TLR4/5KO小鼠下游炎症因子表达明显较TLR5KO及TLR4KO小鼠降低，提示TLR4、TLR5在该炎症反应通路中均可能起重要作用。结论：TLR4、TLR5在E.coli LF82黏附侵袭结肠粘膜过程中起重要作用，为寻找新的药物靶点提供理论依据。